| Результаты этапа: На сегодняшний день, широко признан тот факт, что терапевтическая эффективность мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (МСК) обусловлена их паракринной сигнализацией, в том числе за счет продукции внеклеточных везикул (ВВ). МСК секретируют ВВ, содержащие белки, ДНК, РНК и липиды. Одним из доступных источников МСК является послеродовая плацента человека. Задачами для первого этапа выполнения проекта являлось получение культур МСК из ткани послеродовой плаценты и выделение ВВ из кондиционированной среды культивирования МСК с последующей их подробной характеризацией. Было проведено иммунофенотипирование МСК подтвердившее экспрессию характерных поверхностных маркеров для МСК CD73, CD90, CD105 и при этом отсутствие экспрессии CD14, CD20, CD45, CD34. Руководствуясь требованиями MISEV 2018 к характеристикам ВВ, мы показали, что выделенные нами методом дифференциального центрифугирования ВВ содержат трансмембранный белок СD9, цитоплазматический белок TSG101 и белок внутренней митохондриальной мембраны Mitofilin. При этом в образцах ВВ не были выявлены митохондриальные белки цитохром С и VDAC. В образцах МСК наоборот, были детектированы такие белки как цитохром С, VDAC и Mitofilin, тогда как СD9 и TSG101 обнаружены не были. Протеомным анализом мы также выявили в ВВ характерные маркеры экзосом (CD9, CD63, CD61, Alix, TSG101, CD81, СD82, MFGE8) и микровезикул (TOMM22; Mitofilin; LMNA; Calnexin), согласно MISEV2018. Методом анализа траектории наночастиц (NTA) был произведен количественный подсчет частиц в образцах и их распределение по размерам. В частности, в получаемых нами образцах ВВ от 10 млн МСК из суточной кондиционированной среды количество частиц составляло 5,62 ±1,21518*10^12 при этом максимальное количество частиц находилось в диапазоне размеров от 60 до 80 нм. Трансмиссионная электронная микроскопия образцов ВВ подтвердила данные NTA. Большинство объектов имели характерную для экзосом чашевидную морфологию с размерами от 40 до 300 нм. Незначительная часть более мелких объектов (25–95 нм) имела гладкую или угловатую форму. Нами были изучены нейропротекторные свойства ВВ при моделировании глюкозно-кислородной депривации (ГКД) на первичной культуре нейроглиальных клеток крысы. ВВ статистически значимо защищали клетки от гибели после КГД, что коррелировало со снижением [Ca2+]i во время фазы глобального роста цитозольного кальция. ВВ также индуцировали аберрантную осцилляцию [Ca2+]i в астроцитах через 30 минут ингибирования в нормальных условиях, мы предполагаем, что данный феномен может лежать в основе приобретения ишемической толерантности. ВВ значительно ускоряли рост нейритов в ходе развития нейроглиальной сети гиппокампа in vitro в течение семи суток культивирования. Чтобы выявить возможные сигнальные пути через которые ВВ, продуцируемые МСК плаценты, могут реализовать свой терапевтический потенциал, мы провели протеомный анализ ВВ и последующий биоинформатический анализ идентифицированных белков с использованием базы данных путей Reactome. Идентифицированные пептиды были сопоставлены с 2093 белками. Среди 2093 белков 972 были идентифицированы как минимум в четырех из восьми анализах, проведенных помощью тандемной масс-спектрометрии. В соответствии с результатами Reactome-анализа протеома ВВ МСК, наиболее представлены следующие категории: «Клеточные ответы на внешние стимулы»; «Иммунная система, дегрануляция нейтрофилов»; «Биологические процессы развития». Среди наиболее значимых дочерних категорий в группе «Клеточный ответ на внешние стимулы»: ответ GCN2 на недостаток аминокислот; клеточный ответ на гипоксию; опосредованная шапероном HSP90 регуляция рецепторов стероидных гормонов. Некоторые из наиболее обогащенных путей в группе «Иммунная система» были: «Процессинг и презентация антигена, опосредованные MHC класса I»; «Дегрануляция нейтрофилов»; «Сигнализация интерферона». Самым обогащенным путем в группе «Биология развития» было «Аксональное наведение». На основе полученных данных о наиболее обогащенных сигнальных путях можно предположить, что ВВ могут обладать нейропротекторными свойствами через механизмы, обеспечивающие защиту клеток от стресса (дефицит аминокислот, гипоксия, АФК), иммуномодуляцию, а также спраутинг и наведение аксонов. |
