ИСТИНА

Целью проекта является изучение механизмов модуляции функциональных свойств пенициллинацилаз и выявление путей, позволяющих увеличить эффективность их практического использования.

The aim of the project is to study the modulation mechanisms of the functional properties of penicillin acylases and identify ways to increase the efficiency of their practical use. To achieve this goal, the following tasks will be solved: using bioinformatics and structural analysis methods, previously unknown ligand binding sites different from the currently known active center in the penicillin acylase structure from Escherichia coli will be determined, their functional importance and prevalence in the penicillin acylase family will be evaluated; interactions between different sites of ligand/substrate binding and the active center of penicillin acylase will be investigated using molecular modeling methods, the mechanisms and ways of interaction, networks of amino acid residues involved in this process will be established; experimental verification of the interaction mechanisms between the sites identified by molecular modeling and the known active center of the enzyme will be performed, the influence of these interactions on the "canonical" catalytic activity, substrate and stereospecificity, as well as protein stability and its resistance to various types of inactivation will be established; the ability of penicillin acylase to catalyze previously unknown chemical transformations will be tested, the effect of various ligand binding sites on the discovered new functional properties of the enzyme will be investigated; Methods for modulating the functional properties of penicillin acylases will be revealed, which make it possible to increase the efficiency of using these enzymes in biotechnology through the use of modulating agents, optimization of the substrates structure, and changes in the structure of the protein.

С использованием методов биоинформатики и структурного анализа будут определены ранее неизвестные участки связывания лигандов в структуре пенициллинацилазы из Escherichia coli отличные от известного на данный момент активного центра фермента, проведена оценка потенциала их функциональной важности и распространенности в семействе пенициллинацилаз. При помощи методов молекулярного моделирования и экспериментального изучения будет проверена способность пенициллинацилазы катализировать ранее неизвестные химические превращения (исследованы мунлайтинговые свойства фермента), в первую очередь наличие бета-лактамазной активности. С использованием методов молекулярного моделирования будут исследованы взаимодействия между различными участками связывания лигандов (субстратов) и «каноническим» (известным в настоящее время) активным центром пенициллинацилазы, установлены механизмы и пути взаимодействия, сети вовлеченных в этот процесс аминокислотных остатков. Будет проведена экспериментальная проверка механизмов взаимодействия между участками, выявленными в результате молекулярного моделирования, и известным активным центром фермента, установлено влияние этих взаимодействий на «каноническую» каталитическую активность, субстратную и стереоспецифичность, а также стабильность белка и устойчивость к различным типам инактивации. Будет исследована возможность модуляции основных функциональных свойств фермента.

Накоплены экспериментальные факты, указывающие на целесообразность и обоснованность предлагаемого исследования. Обнаружено, что при проведении ферментативной модификации пенициллинов, катализируемых пенициллинацилазой, наряду с целевыми продуктами образуются продукты разрушения бета-лактамного кольца. Эти факты свидетельствуют о возможной мунлайтинговой активности пенициллинацилаз. Имеются также экспериментальные результаты, которые не вписываются в представление о функционировании одного активного центра в структуре пенициллинацилазы. Не имеет адекватного объяснения обнаруженная нами инактивация фермента в ходе ферментативного синтеза пептидов (Shcherbakova TA, Korennykh AV, van Langen LM, Sheldon RA, Svedas VK. Use of high acyl donor concentrations leads to penicillin acylase inactivation in the course of peptide synthesis, J. Mol. Cat. B:Enzym. 2004, 31, 63-65), а также в реакциях превращения производных аминокислот с неспецифическими для данного фермента ацильными группами (наши неопубликованные данные). Проведенное кинетическое исследование указывает на связывание фермента с несколькими молекулами таких субстратов, что также подтверждает предположение о существовании множественных участков связывания в структуре пенициллинацилазы, роль которых непонятна. Предварительные исследования показывают, что в структуре пенициллинацилазы имеются полости, распределенные по всей поверхности и различающиеся объемом и формой, а также различным соотношением доступных растворителю полярных и неполярных областей. Это указывает на возможность связывания фермента с соединениями самой различной природы. Есть задел в методической части: разработаны наукоемкие методы биоинформатического анализа, позволяющие провести запланированное исследование на современном мировом уровне и реализованные в виде компьютерных программ и доступных веб-серверов. Работа обеспечена в методической части как для проведения этапов молекулярного моделирования, так и для экспериментальных исследований.