Разработка высокоэффективных методов определения биологически активных веществ для целей химического скринингаНИР

Development of highly effective methods for the determination of biologically active substances for the purposes of chemical screening

Источник финансирования НИР

грант Президента РФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 февраля 2021 г.-31 декабря 2022 г. Разработка высокоэффективных методов определения биологически активных веществ для целей химического скрининга
Результаты этапа: По итогам реализации данного этапа проекта в рамках одной из поставленных задач, а именно задачи разработки способов определения антиоксидантов (аскорбиновой кислоты и представителей класса флавоноидов), основанных на использовании наноаналитических реагентов, в том числе треугольных нанопластинок серебра и нанокомпозитных материалов на их основе, проведен комплекс исследований по изучению возможностей использования для этих целей треугольных нанопластинок серебра (ТНП). Получены водные коллоидные растворы ТНП с длиной ребра около 50 нм и полосой поверхностного плазмонного резонанса (ППР) в области 600 – 620 нм концентрацией 56 мг/л. Проведены предварительные эксперименты по изучению взаимодействия аскорбиновой кислоты с нитратом серебра в присутствии ТНП в водных растворах. Установлено, что взаимодействие сопровождается как батохромным сдвигом полосы ППР ТНП, так и значительным увеличением ее интенсивности. Смещение полосы ППР достигает 275 нм, а ее интенсивность увеличивается до 9 раз. Высказано предположение, что вероятный механизм взаимодействия включает восстановление ионов серебра (I) до металлического серебра под действием аскорбиновой кислоты и его осаждение на поверхности затравочных наночастиц ТНП. Данное предположение подтверждается результатами электронно-микроскопического исследования и построения гистограмм распределения по размерам ТНП, которые показали увеличение среднего размера наночастиц. Полученные данные указывают на возможность использования данной аналитической системы для спектрофотометрического, цветометрического или визуально-колориметрического определения содержания аскорбиновой кислоты. В качестве аналитического сигнала изучено два параметра – изменение интенсивности полосы ППР и ее сдвиг по оси длин волн. Установлено, что оба эти параметра связаны с концентрацией антиоксиданта, однако первый отвечает большей линейности градуировочной зависимости и лучшей воспроизводимости, что обосновывает его предпочтительное использование для определения содержания аналита. Изучено влияние внешних факторов на взаимодействие ТНП с нитратом серебра, что будет положено в основу выбора условий проведения аналитической процедуры при определении аскорбиновой кислоты. В частности, показано что время проведения взаимодействия не превышает 5 мин, что является хорошей величиной для реализации быстрых скрининговых анализов. Разработана методология скринингового определения аскорбиновой кислоты в качестве модельного вещества-антиоксиданта. В рамках второго направления проведено изучение возможности применения мини-спектрофотометров – калибраторов мониторов для скринингового анализа. Во-первых, как дешевой, широкодоступной и вместе с тем эффективной альтернативы профессиональным люминесцентным спектрометрам; а во-вторых, для неинвазивного измерения спектральных характеристик живых организмов. Показано, что встроенный источник широкополосного излучения калибратора мониторов i1Pro2 может быть использован не только для измерения поглощения образца, но способен возбуждать люминесценцию некоторых веществ в ближней УФ области. Эта особенность данного устройства в сочетании с реализацией эмиссии/регистрации излучения за один импульс создает очень хорошие перспективы в решении задач скринингового анализа. На примере живых организмов – планарий – показано, что спектральные измерения поглощения с помощью калибратора мониторов могут быть реализованы in vivo, без какого-либо ущерба для организма. Предложена методология измерения спектральных характеристик планарий независимо от их размера, что достигается нормированием зарегистрированных спектров поглощения, а также использованием для качественной и количественной характеризации анализируемых объектов относительных параметров (соотношений оптических плотностей при выбранных длинах волн). В качестве примера применимости разработанного подхода на практике показано его использование для неинвазивного измерения динамики пищеварения у планарий по изменению их спектральных характеристик. Подход может быть перспективен для скрининга состояния живых организмов, в том числе в ответ на условия их существования, связанные с присутствием в среде их обитания биологически активных веществ. Измерение сигнала люминесценции с помощью калибратора мониторов возможно для люминофоров, возбуждающихся в ближней УФ-области (> 350 нм), а процедуру измерения необходимо проводить в кювете с черными (светопоглощающими) стенками. На основании серии экспериментов для кювет различной формы и объема выбран тип кюветы, позволяющий добиться хорошей воспроизводимости измерения сигнала и минимального влияния бликов. Это коммерчески доступные черные полимерные емкости типа Eppendorf. В пользу этого варианта говорит также коммерческая доступность и идентичность свойств данных емкостей от партии к партии. Кроме кювет данного типа (малого объема), измерение люминесценции может быть проведено в верхней части (горлышке) колбы, на поверхность которой нанесен светопоглощающий слой черной краски. Этот вариант рассмотрен для случая проведения экстракционного концентрирования люминесцирующего соединения из большого объема анализируемого раствора со сбором фазы концентрата в верхней части. Возможность применения калибратора мониторов для определения люминесцирующих соединений продемонстрирована на примере родамина 3B и флуоресцеина. Концентрационный предел обнаружения составил 0.01 – 0.03 мкмоль/л. В рамках третьего направления исследований, которое имеет своей целью решение проблем скринингового анализа, когда требуется определять следовые количества веществ, проведен анализ и систематизация данных литературы о современных миниатюризированных методах выделения и концентрирования органических соединений. Предложены высокоэффективные сорбенты на основе сверхсшитого полистирола и магнитного сверхсшитого полистирола для концентрирования нитрофуранов. Показано, что сочетание магнитной твердофазной экстракции на магнитном сверхсшитом полистироле с дериватизацией 5-нитро-2-фуральдегидом метаболитов нитрофуранов приводит к образованию исходных нитрофуранов (фуразолидона, фуралтадона, нитрофурантоина и нитрофуразона), которые могут далее быть определены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС). По сравнению с существующими дериватизирующими агентами, 5-нитро-2-фуральдегид имеет ряд преимуществ, так как есть возможность предварительно выбрать условия для пробоподготовки и определения с использованием коммерческих нитрофуранов, а не других производных метаболитов нитрофуранов, что ускоряет планирование анализа и снижает его стоимость. Магнитный сверхсшитый полистирол был впервые использован для очистки методом магнитной твердофазной экстракции (МТФЭ) перед определением производных метаболитов нитрофуранов в меде с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Подробно исследованы основные параметры, влияющие на дериватизацию и эффективность МТФЭ, и выбраны условия проведения процедуры. Дериватизацию проводят в кислой среде (0,1 М HCl), что соответствует также условиям гидролиза образцов, в присутствии избытка (7 мМ) 5-нитро-2-фуральдегида. Сорбционное концентрирование из объема 5 мл пробы на магнитном сверхсшитом полистироле (20 мг) протекает быстро, за 5 мин, что важно для реализации экспрессных скрининговых анализов. Элюирование осуществляют ацетонитрилом. Оптимизированная методика позволяет просто комбинировать гидролиз, дериватизацию и заключительный этап МТФЭ. Разработанный способ проверен при анализе меда с добавлением четырех метаболитов нитрофуранов в дозах 1, 2 и 200 мкг/кг. Для всех аналитов было достигнуто извлечение> 85%. Градуировочные графики линейны в диапазоне 1–200 мкг/кг. Относительные стандартные отклонения не превышают 0.15. Пределы обнаружения метаболитов нитрофуранов составили 0.1–0.3 мкг/кг, а пределы определения – 0.3–1.0 мкг/кг. Предложенный способ хорошо зарекомендовал себя при анализе реальных образцов меда. С целью разработки подхода к решению задач многокомпонентного скрининга, получены данные о возможностях использования сверхсшитого полистирола для одновременного извлечения 63 ветеринарных препаратов при их определении в курином мясе методом ВЭЖХ-МС/МС. Набор аналитов включал ветеринарные препараты различных классов (сульфаниламиды, тетрациклины, хинолоны, амфениколы, нитроимидазолы, β-лактамы, макролиды, линкозамиды и плевромутилины). Пробоподготовка включает экстракцию аналитов буферным раствором Макилвейна, удаление жиров экстракцией гексаном и дальнейшую сорбцию на картриджах, заполненных сверхсшитым полистиролом. Показано, что способ обеспечивает количественное выделение аналитов (степени выделения превышают 83%) и хорошую воспроизводимость (относительное стандартное отклонение не более 0.12). Матричный эффект для всех ветеринарных препаратов был ниже 20%, что является прямым следствием применения сверхсшитого полистирола для отделения мешающих компонентов матрицы. Определение проводили методом матричной градуировки, пределы обнаружения и определения составили 0.01–0.3 и 0.02–1 нг/г соответственно. Анализ загрязненных образцов куриного мяса показал, что результаты удовлетворительно совпадают с данными, полученными методами, принятыми в Российской Федерации для определения различных групп антибиотиков. Предложен подход к определению нитроимидазолов, составляющих основу ветеринарных антимикробных препаратов, основанный на их концентрировании на магнитном сверхсшитом полистироле и последующем определении методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. На примере метронидазола, орнидазола, ронидазола и тинидазола показано, что сорбционное концентрирование нитроимидазолов на магнитном сорбенте может быть осуществлено за 5 – 10 мин из растворов с рН 5 – 7. Выбраны условия разделения указанных биологически активных веществ на хроматографической колонке Luna C18 за время, не превышающее 10 мин. Полученные экспериментальные данные создают основу для дальнейшего исследования аналитических возможностей сверхсшитого и магнитного сверхсшитого полистирола в качестве эффективных сорбентов для многокомпонентной твердофазной экстракции в процессе пробоподготовки перед скрининговым определением остатков ветеринарных препаратов и других биологически активных веществ.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Разработка высокоэффективных методов определения биологически активных веществ для целей химического скрининга
Результаты этапа: В рамках одной из поставленных задач, связанной с изучением возможностей наноаналитических реагентов для скринингового определения антиоксидантов, разработан способ определения аскорбиновой кислоты с помощью треугольных нанопластинок серебра (ТНП). Установлено, что взаимодействие треугольных нанопластинок серебра с аскорбиновой кислотой в присутствии нитрата серебра сопровождается батохромным смещением и увеличением интенсивности полосы поверхностного плазмонного резонанса ТНП. Этот эффект положен в основу способа определения этого антиоксиданта. Аскорбиновая кислота является маркером антиоксидантной активности, кофактором многих ферментов и веществом-предшественником биосинтеза некоторых важных метаболитов. Поэтому поиск недорогих, экспрессных и чувствительных способов определения аскорбиновой кислоты в продуктах питания, а также оценки их антиоксидантной активности, является актуальной задачей аналитической химии. Предполагаемый механизм взаимодействия включает восстановление ионов Ag(I) до металлического серебра под действием определяемого соединения и осаждение металлического серебра на поверхности ТНП-затравок, что приводит к их укрупнению. Показано, что данный процесс протекает в среде близкой к нейтральной; в щелочной среде не только не наблюдается батохромного сдвига полосы локализованного поверхностного плазмонного резонанса ТНП серебра, но, наоборот, наблюдается гипсохромный сдвиг в область 400–410 нм, а интенсивность полосы в этих условиях возрастает незначительно. При высоких рН, кроме полосы поглощения в области 400–410 нм, в спектрах поглощения имеется плечо в характерной для ТНП области 600–620 нм, что говорит о том, что они остаются неизменными в рассматриваемом процессе. На основании этих и других полученных в работе данных показано, при проведении реакции в щелочной среде в качестве продукта преимущественно образуются сферические наночастицы серебра, в то время как в нейтральной среде происходит образование треугольных нанопластинок. Проведены электронно-микроскопические исследования образцов с использованием просвечивающего электронного микроскопа с катодом с термополевой эмиссией при ускоряющем напряжении 200 кВ. Информационный предел при регистрации изображений в режиме светлопольной просвечивающей микроскопии был лучше 0.1 нм. Для проведения анализа образцы в виде суспензии наносили на поддерживающую сеточку из меди с пленкой из формвара и нанесенного на него слоя углерода. Перед установкой в микроскоп образцы сушили сначала на воздухе в течение 20–30 мин и затем в вакууме в течение 10–12 ч. На основании анализа микрофотографий более 100 наночастиц построена гистограмма их распределения по размерам до и после взаимодействия с аскорбиновой кислотой в присутствии нитрата серебра. Из полученных данных установлено, что в результате взаимодействия средняя длина ребра ТНП серебра возрастает примерно в 2 раза, что подтверждает предположение об их укрупнении. Кроме того, высказано предположение, что процесс сопровождается образованием агрегатов ТНП, наличие которых в водном растворе подтверждено просвечивающей электронной микроскопией высокого разрешения в светлом поле. С привлечением результатов исследования разработан способ определения аскорбиновой кислоты с пределом обнаружения 0.5 мг/л и диапазоном определяемых содержаний 1.7–60 мг/л. Среди задач современной аналитической химии можно выделить миниатюризацию аналитических систем и снижение себестоимости анализа, что особенно важно применительно к химическому скринингу. В ряде случаев решение этих задач возможно при использовании бытовых цветорегистрирующих устройств: смартфонов, сканеров, фотоаппаратов. Особенно перспективны в этом плане калибраторы мониторов – устройства, которые позволяют измерять не только координаты цвета, но и фиксировать коэффициенты диффузного отражения на разных длинах волн, что существенно повышает информативность анализа. В связи с этим, в рамках другого направления проекта разработана методология применения калибраторов мониторов для измерения люминесценции. Предлагаемый подход основан на том, что калибратор мониторов облучает образец излучением в видимом и ближнем УФ-диапазоне. При прохождении излучения через раствор в кювете с черными стенками происходит возбуждение молекул люминофора и их флуоресценция. Прибор при этом регистрирует попадающее на детектор вторичное излучение. На примере родамина 3В, флуоресцеина и хинина показано, что нормированные спектры люминесценции, зарегистрированные с помощью спектрофлуориметра и калибратора, совпадают по форме. Проведён выбор кюветы для измерений. В качестве кювет были рассмотрены пластиковые блистеры, тигель для микроанализа, стаканчик для микроанализа, микропробирки типа «эппендорф», пробирки и некоторые другие промышленно выпускаемые емкости. Установлено, что целесообразнее всего для анализа использовать коммерчески доступные микропробирки типа эппендорф. Получены спектры люминесценции родамина, флуоресцеина и хинина, зарегистрированные с помощью калибратора мониторов и зависимости интенсивности люминесценции от концентрации люминофора. В определённом диапазоне концентраций полученные зависимости монотонны, их можно аппроксимировать экспоненциальной функцией и использовать в качестве градуировочных. Оценены некоторые аналитические характеристики определения перечисленных люминофоров с использованием калибратора мониторов. Показано, что для родамина и флуоресцеина, полосы возбуждения которых находятся в видимой области, чувствительность определения заметно выше, чем в случае хинина, максимум возбуждения которого составляет 350 нм. Методом «введено-найдено» подтверждена возможность определения родамина и флуоресцеина в присутствии 1000-кратного избытка распространённых неорганических ионов и в водопроводной воде. Применимость подхода продесонстрирована при определении хинина в газированных напитках Швепс и Индиан Тоник и лекарственном препарате Анальгин-Хинин. Результаты хорошо согласуются с данными, полученными на профессиональном флуориметре, а также данными независимого метода. Калибратор уступает флуориметру в чувствительности, но зато выигрывает в экспрессности и отличается меньшей стоимостью аппаратуры и расходных материалов, что важно для химического скрининга. При скрининге малых содержаний биологически активных веществ большую роль играет стадия предварительного концентрирования, которую с экологической и практической точек зрения целесообразно реализовывать сорбционными методами. В рамках этого направления проведено сравнение сорбентов для концентрирования дофамина, относящегося к классу катехоламинов. Катехоламины – класс органических соединений, выполняющих в организме человека и животных множество различных жизненно важных функций, таких как регулирование состояния стресса, психомоторной деятельности, эмоций, обучения, сна и памяти. Значительной проблемой при скрининговом определении катехоламинов является их невысокая концентрация во многих объектах анализа. Это обусловливает необходимость предварительного концентрирования данных соединений из растворов. Проведено сравнение особенностей адсорбции дофамина на сорбентах γ-Al2O3 и Strata-SDBL и сделана оценка физико-химических характеристик адсорбции и перспектив использования данных сорбентов для концентрирования катехоламинов. В результате исследования сорбции в широком диапазоне рН показано, что из кислых растворов сорбция невелика. Максимальная адсорбция достигается при рН 8-9 на γ-Al2O3 и в диапазоне рН 5-11 на Strata-SDBL. Поэтому при использовании в практике сорбционного концентрирования первого сорбента необходим контроль рН, в то время как для второго эта необходимость отсутствует, что в ряде случаев может существенно упростить процедуру концентрирования. Изучено влияние времени на сорбцию дофамина. Показано, что максимальная степень извлечения достигается для γ-Al2O3 (R=87±3%) и Strata-SDBL (R=50±4%) за 20 мин. Необходимо отметить, что γ-Al2O3 характеризуется меньшей скоростью адсорбции, но большей величиной равновесной удельной адсорбции. Это важно, если речь идет о концентрировании в статическом режиме катехоламинов при скрининге проб с их низким содержанием. Для Strata-SDBL равновесие между сорбентом и водной фазой устанавливается уже за 5 мин, что перспективно для экспрессного сорбционного концентрирования в динамическом режиме. Построены изотермы адсорбции и рассчитаны некоторые термодинамические параметры сорбции. Сделан вывод, что γ-Al2O3 имеет в 2 раза бóльшую емкость по отношению к дофамину и характеризуется в 6 раз большей константой адсорбции, чем Strata-SDBL. Высказано предположение о том, что большее сродство дофамина к γ-Al2O3, вероятно, связано с тем, что удерживание на нем происходит за счет сильных электростатических взаимодействий и водородных связей; в случае Strata-SDBL механизм адсорбции, скорее всего, основан на более слабых гидрофобных и π-π-взаимодействиях с сорбатом. Помимо концентрирования определяемых веществ, при скрининговом анализе образцов сложного состава большую роль играет их пробоподготовка. В рамках проекта предложен способ быстрой пробоподготовки образцов пищевых продуктов при определении в них метаболитов нитрофуранов методом ВЭЖХ-МС/МС, основанный на использовании 5-нитро-2-фуральдегида в качестве нового дериватизирующего агента. Нитрофураны – класс синтетических антибактериальных и противопаразитарных препаратов широкого спектра действия, которые быстро метаболизируют в организме, давая метаболиты с канцерогенным и мутагенным действием. Это обусловливает необходимость разработки скрининговых методов их определения в пищевых продуктах животного происхождения. В рамках проекта с целью снижения времени анализа изучено влияние температуры и концентрации соляной кислоты на определение метаболитов нитрофуранов в курином мясе методом ВЭЖХ-МС/МС с использованием 5-нитро-2-фуральдегида при проведении пробоподготовки в термостатированной ультразвуковой ванне. Полученные результаты указывают на то, что повышение температуры от 40 до 80°C позволяет снизить время гидролиза-дериватизации в 0.1 М HCl с 16 ч до 60 мин; в присутствии 0.5 М HCl при 80°C время гидролиза-дериватизации можно снизить до 20 мин. Кроме того, показано, что в условиях эксперимента удается повысить выход продуктов дериватизации на 11–49%. Показана возможность применения разработанного подхода для определения метаболитов фуралтадона, фуразолидона, нитрофурантоина и нитрофуразона в курином мясе, печени, желудках и сердце кур.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".