![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Данный проект посвящен трансляции знаний о структурно-функциональных соотношений в белках в понимание молекулярных механизмов заболеваний, обусловленных мутациями кодирующих белки генов. Проект фокусируется на исследовании обусловливающих редкие формы болезни Шарко-Мари-Тута (БШМТ) и эпилепсии мутаций белков, связывающих коферментные формы витаминов B1 и B6: тиаминдифосфат (ТДФ) и пиридоксаль-5’-фосфата (ПЛФ).
Our project is dedicated to understanding molecular mechanisms of the rare neurological disorders caused by mutations of proteins binding the coenzyme forms of vitamins B1 and B6, i.e. thiamine diphosphate (ThDP) and pyridoxal-5’-phosphate (PLP). Some of the known mutations of such proteins underlie rare forms of Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease and epilepsy. We plan enzymological study of the mutations-induced changes in the protein functions, added by development of diagnostic approaches for the rapid and low-cost identification of the rare forms of CMT and epilepsy, caused by the enzymes under our investigation.
В результате запланированного исследования будет достигнут новый уровень понимания между соотношением структуры и функции белков, связывающих природные производные витаминов В1 и В6. Определение таких соотношений необходимо для решения вопроса о функциональной значимости идентифицируемых методами секвенирования мутаций генома человека и животных на уровне целостного организма. В свою очередь, такие знания востребованы развитием персонифицированной медицины, поскольку на данный момент далеко не все из идентифицируемых в белках человека мутаций могут быть оценены с функциональной и патофизиологической точек зрения. Решение задачи по определению НАД+ в биологических образцах пациентов с неврологическими нарушениями покажет, может ли такой анализ быть применен для лучшей диагностики редких форм неврологических заболеваний, молекулярная основа которых включает ферменты, которые будут изучены в проекте.
Российская исследовательская группа давно изучает ТДФ-зависимые дегидрогеназы 2-оксокислот, в частности, 2-оксоадипатдегидрогеназу, кодируемую геном DHTKD1, и пируватдегидрогеназу, а также имеет опыт совместной работы с врачами и клиническими исследователями. Участниками проекта разработаны методы специфической регуляции таких дегидрогеназ in vivo с использованием синтетических аналогов 2-оксосубстратов. Итальянская исследовательская группа имеет многолетний опыт изучения ферментов, участвующих в метаболизме витамина В6. Энзимологические исследования группы проводятся с использованием подходов молекулярной биологии и генетической инженерии. Группа работает в сотрудничестве с кристаллографами и генетиками для исследований мутированных белков in vivo с использованием дрозофилы в качестве модельного организма.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 28 января 2021 г.-2 февраля 2022 г. | Молекулярные основы редких неврологических заболеваний, обусловленных мутациями пиридоксальфосфат- и тиаминдифосфат-связывающих белков. |
Результаты этапа: В ходе выполнения первого этапа проекта нами была апробирована экспериментальная модель неврологических нарушений при ингибировании пируватдегидрогеназы и 2-оксоадипатдегидрогеназы (ОАДГ) фосфонатными аналогами пирувата и 2-оксопимелата, соответственно. Полученные данные показывают, что наиболее выраженные отклонения физиологических параметров от контрольных наблюдаются при интраназальном введении мембранопроницаемого предшественника ингибитора ОАДГ - триэтилового эфира адипоилфосфоната. Предполагаемый в дальнейшем анализ биохимических параметров мозга экспериментальных животных покажет, связано ли отсутствие наблюдаемых физиологических изменений при ингибировании пируватдегидрогеназы с компенсаторными ответами метаболической сети на биохимическом уровне, в частности, с компенсаторным ростом активности фермента в результате его дефосфорилирования. В 2021 г. были установлены особенности регуляции тиамином пиридоксалькиназы и известных у человека вариантов данного фермента, продемонстрировано влияние введения крысам тиамина на суточную регуляцию активности пиридоксалькиназы и экспрессию связанных с суточными ритмами киназ в мозге (Bunik et al., 2022). Структурно-функциональный анализ известных мутаций в гене DHTKD1 человека выявил мутации, действие которых на развитие неврологических симптомов при болезни Шарко-Мари-Тута и эпилептических судорогах может быть витамин-зависимым. Ввиду близости мутаций V360A, L697R и R715C к сайту связывания тиаминдифосфата можно ожидать, что терапия высокими дозами витамина B1 или его фармакологических производных приведет к ослаблению неврологических симптомов у пациентов с такими мутациями. В ходе дальнейшего исследования по проекту предполагается получить все рекомбинантные компоненты полиферментного комплекса ОАДГ и реконструировать из них активный полиферментный комплекс. В результате будет разработана система, позволяющая проверять предсказанную функциональную роль мутаций ОАДГ in vitro с помощью экспрессии мутантных форм ОАДГ. Мы показали, что активность изолированной ОАДГ слишком низка для достоверной детекции ее изменений как в системе с искусственными акцепторами электронов, так и методом кругового дихроизма. На основе наших экспериментов по термокалориметрии экспрессированной ОАДГ и ранее проведенных исследований гомологичных ОАДГ ферментов можно предположить, что низкая активность связана с малой стабильностью рекомбинантного фермента в отсутствие гетерологических взаимодействий с компонентами комплекса. Таким образом, биологически значимые функциональные исследования ОАДГ требуют включения фермента в состав полиферментного комплекса. С целью разработки методов анализа образцов крови человека на потенциальные маркеры мутаций исследуемых ферментов в 2021 г нами был произведен сбор биологических образцов пациентов с неврологическими патологиями, а также контрольных образцов. Были отработаны и оптимизированы протоколы забора и хранения крови, методы пробоподготовки и анализа уровней НАД+ и белков, связывающих тиаминдифосфат и пиридоксальфосфат, функция которых может нарушаться при патологии Шарко-Мари-Тута и витамин-зависимых эпилепсиях. На последующих этапах проекта предполагается дальнейшее накопление биоматериала и количественный анализ изучаемых маркеров для вывода об их диагностическом потенциале. | ||
2 | 12 мая 2022 г.-12 января 2023 г. | Молекулярные основы редких неврологических заболеваний, обусловленных мутациями пиридоксальфосфат- и тиаминдифосфат-связывающих белков. |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта в 2022 г. были охарактеризованы биохимические индикаторы нейропатологий в животных моделях и в крови человека, изучены их изменения по сравнению с контрольной группой, кардиопациентами и при терапевтическом воздействии введения витамина В1: 1 Определили достоверное падение уровня низкомолекулярной формы ОАДГ у неврологических и кардиологических пациентов по сравнению с соответствующими возрасту контрольными группами. 2. Обнаружили одновременные уменьшения экспрессии ОАДГ и уровня НАД+ в крови человека и положительную корреляцию между содержанием ОАДГ и НАД+ в крови неврологических пациентов до витаминотерапии. Введение высоких доз тиамина у неврологических пациентов вызывало рост ОАДГ и исчезновение корреляции. Таким образом, мы показали сопряженные изменения ОАДГ и НАД+. 3. Количественный анализ ПЛФ-зависимых ферментов в крови человека показал, что по сравнению с контролем в группе кардиологических пациентов уровень ПНФО повышается, а ПЛК – понижается. Аналогичные изменения у неврологических пациентов менее выражены: статистическая значимость наблюдается лишь для повышения ПНФО по сравнению с контролем. Существенно, что уровни ПЛК в крови значимо отличаются у мужчин и женщин | ||
3 | 3 февраля 2023 г.-2 февраля 2024 г. | Молекулярные основы редких неврологических заболеваний, обусловленных мутациями пиридоксальфосфат- и тиаминдифосфат-связывающих белков. |
Результаты этапа: Проведенные нами в ходе выполнения проекта энзимологические, биоинформатические и клинические исследования позволили углубить понимание соотношения структуры и функции ПЛФ-зависимых, создать новые и/или применить уже имеющиеся животные модели БШМТ и эпилепсии для изучения механизмов и разработки терапий данных заболеваний, предложить новые диагностические подходы для понимания механизмов и характеристики терапевтических эффектов в БШМТ, а также апробировать терапевтическое действие витаминов В1 и В6 в целевых невропатологиях. Так, в клинике был апробирован основанный на сделанных нами теоретических предсказаниях подход к терапии БШМТ витамином В1. Мы показали улучшение мышечной силы сгибателей рук и неврологического статуса при ежедневном оральном введении 100 мг витамина В1 или 200 мг сульбутиамина. Поскольку БШМТ - это группа заболеваний, при которых поражаются двигательные и/или сенсорные периферические нервы, что приводит к мышечной слабости и атрофии, а также к потере чувствительности, данный результат хорошо согласуется с известным действием тиамина при невропатологиях, сопровождающихся митохондриальной дисфункцией. Кроме того, поскольку ТДФ является активатором пируватдегидрогеназы (ПДГ) и ингибитором киназы данного фермента, введение тиамина (витамина В1) может быть формой терапевтического лечения пациентов с заингибированной ПДГ. Ингибирование ПДГ наблюдается как при вызывающих БШМТ мутациях ПДГ или ее киназы, так и в результате дисфункции митохондрий, вызванной другими мутациями, ведущими к БШМТ. В результате проведенной работы показано, что диагностика путем иммунохимического определения митохондриальных ТДФ-зависимых дегидрогеназ в крови человека сопряжена со значительными трудностями. Во-первых, основная масса клеток крови - не содержащие ядер и митохондрий эритроциты, поэтому для детекции митохондриальных дегидрогеназ, которые по последним данным также могут быть локализованы в ядрах, требуется концентрация белкового содержимого образцов крови. Во-вторых, солюбилизация белков из концентрированных метанол-уксусных осадков белков крови для иммунохимического анализа уменьшается при хранении осадков, что затрудняет получение сходимых результатов. В-третьих, результаты тестирования специфичности коммерческих антител к целевым белкам в крови у производителей не представлены, а по нашим данным наиболее представленные полосы ТДФ-зависимых дегидрогеназ пирувата и 2-оксодипата, определенных этими антителами в осадках белков крови, обладали нехарактерными для белков молекулярной массой. Несмотря на завышенную массу ПДГ (около 50 кДа), определенную с использованием антител как на ПДГ, так и на ее фосфо-форму, были получены интересные результаты по гендерным различиям в фосфорилировании ПДГ, соответствующие известной из животных экспериментов зависимости экспрессии киназы ПДГ. Для известной изоформы ОАДГ 130 кДа был показан рост экспрессии в крови пациентов в ответ на оперативное вмешательство. Однако основные иммунореактивные полосы в данном случае были на уровне 50 и 36 кДа. В качестве альтернативных индикаторов тиамин-зависимого метаболизма в крови человека мы использовали активность цитозольного ТДФ-зависимого фермента – транскетолазы – и уровень коферментной формы тиамина – ТДФ. Определение данных индикаторов было успешно применено для оценки терапевтического эффекта витамина В1 у пациентов с БШМТ и его молекулярных механизмов. При характеристике ПЛФ-зависимых ферментов найдены потенциальные участки структуры для передачи активного альдегида ПЛФ от ферментов его синтеза к ферментам, использующим ПЛФ в качестве кофермента, и охарактеризована регуляция пиридоксалькиназы тиамином и его производными. Полученные данные применены при разработке терапевтического подхода к коррекции изменений метаболизма мозга, возникающих после судорог, с помощью комбинированного введения витаминов В1 и В6. Разработанная в животной модели схема введения витаминов В1 и В6 показала корректирующее действие витаминов на изменяющиеся вследствие судорог витамин-зависимые процессы, зависимые от 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, транскрипционного регулятора р53 и сиртуинов 3 и 5. Таким образом, при реализации проекта получены новые данные о роли витамин-зависимых ферментов и витаминов В1 и В6 в развитии и терапии патологических состояний. На этой основе предложены и реализованы подходы к терапии витамином В1 БШМТ в клинике. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".