ИСТИНА

Проект посвящен поиску новых источников и типов биологически активных природных соединений, обладающих антиоксидантной, антивирусной, антибактериальной активностью, которые могут быть использованы при разработке новых технологий здоровьесбережения, в том числе, для улучшения действенности антибактериальных и антивирусных препаратов. Конкретными задачами проекта является разработка эффективных способов направленного извлечения компонентов с заданной биологической активностью из природных гуминовых систем.

The problem of searching for new sources and types of biologically active natural compounds is the most important task of modern chemistry, since both the emergence of new health-preserving technologies and the improvement of the effectiveness of antibacterial and antiviral drugs depend on the availability and effectiveness of such compounds. One of the most interesting and little-studied classes of biologically active natural compounds are humic substances. They are formed as a result of the oxidative degradation of biomacromolecular precursors - lignins, tannins, polysaccharides, proteins and lipids. As a consequence, their structure is characterized by extreme heterogeneity. Humic substances have a wide range of biological activities, including antioxidant and antiviral properties, the ability to bind to proteins, etc. At the same time, they are characterized by very low toxicity (they are non-toxic in the entire range of natural concentrations) and good solubility in water. This makes it possible to consider HS components as ideal candidates for both basic and adjuvant therapy. At the same time, their widespread use is hindered by the extreme heterogeneity and high level of isomeric complexity of their molecular composition. In this regard, the specific task of the project is to develop effective approaches to the targeted extraction of components with a given activity from natural humic substances. To solve this problem, it is planned to significantly increase the separation ability of multidimensional chromatography due to the pre-fractionation of HS on cartridges for solid-phase extraction (SPE) according to the acidity (pKa) of the components, or polarity, with subsequent separation according to orthogonal coordinates: "molecular weight" (using gel chromatographic column) and "polarity" (using a reversed phase column). For the first time, an in-depth study of the chemical diversity of the fine HM fractions obtained by different schemes will be carried out using ion cyclotron resonance mass spectrometry (FT ICR MS). The convolution of the obtained information on the types of relationship between the molecular composition, biological activity, and the HS fractionation scheme will be carried out by machine learning methods in the form of a predictive model that can predict the fractionation scheme for isolating the HS fraction with a given biological activity based on the data on the molecular composition of the initial HS sample. Thus, for the first time, the possibility of the directed selection of the “pixel” of the molecular space of the HS, or rather, its projection onto the Van Krevelen diagram, will be realized. The scale of the problem to be solved is determined by the fact that the developed algorithm will be sufficiently unified and applicable for various types of humic systems, the resources of which are huge reserves of fossil organogenic raw materials (oxidized coal, peat, sapropel), products of processing plant and protein raw materials, mummy, and other oxygenated systems that cannot be separated by rectification. In fact, within the framework of this project, the problem of finding analogues for a rectification column for obtaining fine molecular fractions of oxygen-containing precursors from natural multicomponent systems will be solved.

В результате выполнения проекта будут решены несколько крупных теоретических и практических задач и получены важные научно-практические результаты. Так, будет сформирована представительная выборка образцов ГВ различного происхождения (уголь, торф, пелоиды) и получен блок данных, полученных методом масс-спектрометрии ион-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье с ионизацией электроспреем (МС ИЦР ПФ ЭР) по их молекулярному составу с использованием основного объекта инфраструктуры – масс спектрометра solariX 15T. Важным результатом проекта станет разработка различных схем тонкого фракционирования ГВ, включая принципиально новый– предфракционирование на картриджах ТФЭ по величине кислотности (pKa) компонентов, или по полярности, с последующим разделением по ортогональным координатам: «молекулярная масса» (использование гель-хроматографической колонки) и «полярность» (использование обращенно-фазовой колонки). Введение стадии «предфракционирования» позволит существенно увеличить разделительную способность двумерной хроматографии и, как следствие, увеличит разрешающую способность МСИЦР ПФ спектрометра. В результате будет получен беспрецедентный пул данных о молекулярном составе каждого образца ГВ, полученный как суперпозиция данных о молекулярном составе тонких фракций ГВ, выделенных с помощь. различных схем фракционирования. Обработка данного пула методами байесовской статистики и машинного обучения впервые позволит получить представление о «полном» молекулярном составе ГВ и построить модель для предсказания “пропущенных сигналов” в спектре ГВ.

Коллектив авторов имеет большой опыт совместной работы и научный задел в области исследования гуминовых веществ. В частности, Волков Д.С. являлся исполнителем по проекту РНФ 16-14-00167 (руковдитель - Перминова И.В.) "Высокоэффективные "зеленые" агрохимикаты на основе гуминового сырья" в 2016-2018 гг. В ходе совместных работ Волкова Д.С. и группы Перминовой И.В. получены следующие результаты. Реализован способ последовательной твердофазной экстракции иолекулярных компонентов гиматомелановых кислот (ГГМ) при градиентном понижении pH: 7, 5, 3 и 2, что позволило получить фракции гуминовых веществ с различными кислотными свойствами. С помощью ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии сверхвысокого разрешения был установлен постепенный сдвиг доминирующих каркасов во фракциях ГГМ от восстановленных насыщенных к окисленным ароматическим соединениям. Увеличение средней ароматичности фракции ГГМ сопровождалось красным сдвигом спектров флуоресценции. Эти результаты были подтверждены экспериментами двумерного ЯМР (HSQC и HMBC). Так же следует отметить долговременный опыт научного сотрудничества Dr. Mourad Harir c проф. Перминовой И.В. и д.м.н. Жерновым Ю.В. Результатом данного сотрудничества стали совместные наработки по тонкому фракционированию гуминовых веществ, по молекулярному составу узких фракций гуминовых веществ и взаимосвязи молекулярного состава и биологической активности гуминовых веществ. В целом, коллектив имеет многолетний опыт анализа гуминовых веществ с помощью метода масс-спектометрии сверхвысокого разрешения, методов молекулярной спектроскопии (ИК, УФ, флуоресцентной), методов атомной спектрометрии(ИСП-АЭС, ИСП-МС, ААС, РФА).

Целью Проекта являлась разработка эффективных подходов к направленному извлечению компонентов с заданной активностью из природных гуминовых веществ (ГВ). Для решения данной задачи планировалось использовать такие мощные технологии разделения многокомпонентных смесей, как твердофазная экстракция (ТФЭ) с градиентом по величине кислотности (pKa) и по полярности, а так же эксклюзионную и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Хроматографический метод обладает гораздо более высоким разрешением по сравнению с традиционно используемым для ГВ методом ТФЭ, поэтому развитие методических подходов применения ВЭЖХ для получения тонких фракций ГВ являлось одной из главных задач проекта. Не менее важным аспектом было углубленное изучение молекулярного состава тонких фракций ГВ, полученных с использованием различных схем фракционирования, с помощью масс спектрометрии высокого и сверхвысокого разрешения (МСВР). Поэтому наряду с исследованиями, запланированными на объекте инфраструктуры – масс-спектрометре ИЦР ПФ, был выполнен обширный блок работ с использованием МС-Орбитрэп. Для обработки данных была создана вычислительная платформа. В проекте интенсивно исследовалась биологическая активность полученных фракций (антиоксидантная активность, ингибирующая способность в отношении бета-лактамаз, антивирусная активность по отношению к ВИЧ) Для выявления взаимосвязей между молекулярным составом и биологической активностью фракций ГВ, полученных с использованием различных схем фракционирования, использовали методы корреляционно-регрессионного анализа с валидацией регрессионных моделей. В итоге созданы все предпосылки для поиска и выделения новых биологически активных соединений гуминовой природы. В результате выполнения Проекта предложены подходы и условия, позволяющие реализовать различные схемы разделения ГВ: осаждение при различных рН с последующей обращенно-фазовой (ОФ)-ВЭЖХ; выделение ГВ на картриджах ТФЭ при различных рН, разделение методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ); выделение на ТФЭ в условиях градиента полярности. Разработанная методика ОФ ВЭЖХ на основе изопропанола успешно применена к фракциям гуминовых кислот (ГК), осажденным при различных рН. Фракционирование ГК осаждением при различном рН показало перспективность для предварительного разделения перед ВЭЖХ. Спектры поглощения однозначно показывают разделение ГК на узкие фракции при таком подходе. Методом МС ИЦР ПФ впервые определены молекулярные составы узких фракций препарата ГВ, полученных различными способами разделения: по полярности, рКа и молекулярной массе. Впервые показано, что максимальное различие молекулярного состава фракций наблюдается при разделении по величине рКа. Установлено, что наиболее активными являются максимально гидрофобные фракции. Это справедливо как для ингибирующей способности, так и антиоксидантной активности ГВ. Указанные гидрофобные фракции извлекаются на саамом первом этапе при разделении по рКа и на последнем – по полярности. Тем самым показано, что наиболее перспективным методом фракционирования ГВ является разделение по pКа. В Проекте получен обширный блок данных по ингибирующей активности ГВ по отношению к бета-лактамазам TEM-1, мутантам TEM-1, а также к бета-лактамазе CTX-M типа. Наибольшую ингибирующую активность, как и в случае ГК угля, проявляли фракции с наименьшей полярностью/кислотностью. Для генерации дескрипторов молекулярного состава фракций ГВ на основе данных МС-ИЦР ПФ требовалась автоматизация вычислительных процедур. В данном программном обеспечении необходимо было предусмотреть переход в 20-мерное пространство путем расчета заселенности диаграммы ван Кревелена, а так же их объединения в хемотипы. ПО было разработано и опубликовано под названием NOMspectra. Тем самым была создана вычислительная платформа для работы с массивами данных по проекту – их подготовки для генерации прогнозных моделей. С помощью данной вычислительной платформы обработаны данные МСИЦР ПФ и Орбитрэп для более чем 200 узких и тонких фракций ГВ и установлен целый ряд количественных взаимосвязей «молекулярный состав - биологическая активность». В частности, построены прогностические модели «молекулярный состав – анти-бета-лактамазная активность». «молекулярный состав - анти-ВИЧ активность» и молекулярный состав – антиоксидантная активность». Выполненный блок работ впервые позволил установить ведущую роль гидрофобных ароматических – флавоноидных и лигнинных - алициклических компонентов ГВ для различных типов биологической активности. Тем самым, в Проекте впервые созданы теоретические основы фракционирования ГВ, направленного на выделение биологически активных фракций, разработано методическое обеспечение, предложен высокопроизводительный метод для выделения препаративных количеств узких фракций ГВ, разработана вычислительная платформа для генерации молекулярных дескрипторов ГВ и создания прогностических моделей «молекулярный состав – биологическая активность». Определены наиболее перспективные направления фракционирования и молекулярного моделирования биологической активности ГВ. По сути, созданы предпосылки для генерации банка биологически активных субстанций гуминовой природы с целью углубленного исследования их активности в моделях in vitro и in vivo. Разработанное ПО обеспечивает возможность использования машинного обучения для направленного поиска наиболее активных фракций и алгоритмов их выделения. Таким образом, цель Проекта достигнута. Все поставленные задачи выполнены.