Разработка прототипа вакцины против сибирской язвы на основе сферических частиц вируса табачной мозаикиНИР

Development of vaccine prototype against anthrax based on tobacco mosaic virus spherical particles

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 21 апреля 2021 г.-31 декабря 2021 г. Разработка прототипа вакцины против сибирской язвы на основе сферических частиц вируса табачной мозаики
Результаты этапа: 1. Получена генно-инженерная конструкция pQE-30-mrPA1+2, позволяющая экспрессировать в бактериальных клетках E.coli фрагмент РА, содержащий домены 1 и 2 с модификациями сайтов протеолиза.и дезамидирования. Домены РА 1 и 2 содержат два сайта, чувствительных к протеолитическому расщеплению. В соответствии с ранее опубликованными работами (Ramirez et al.,2002; Zomber et al., 2005) были проведены аминокислотные замены в сайте расщепления фурином , а два фенилаланина в положениях 313 и 314 были удалены в сайте расщепления химотрипсином. Также Asn в позиции 162 (в сайте дезамидирования) был замененн на Gln Получена генно-инженерная конструкция pQE-30-mrPA83, позволяющая экспрессировать в бактериальных клетках E.coli mrPA 83 со всеми модификациями, полученными в mrPA1+2 и mrPA3+4. Конструкция, содержащая домены 3 и 4 с модификацией сайтов дезамидирования (с заменами Asn713 и Asn719 на Gln) была получена в ходе выполнения Проекта 2018. Некоторые подходы, использованные для создания конструкций, описаны в статье, приведенной в отчете: Kondakova O.A., Ivanov P.A., Baranov O.A., Ryabchevskaya E.M., Arkhipenko M.V., Skurat E.V., Evtushenko E.A., Nikitin N.A., Karpova O.V.// Clinical and experimental vaccine research. 2021. V. 10. №. 2. P. 123-131. DOI:10.7774/cevr.2021.10.2.123. 2. Генно-инженерные конструкции pQE-30-mrPA1+2, pQE-30-mrPA3+4 и pQE-30-mrPA83 экспрессированы в клетках E. сoli. Осуществлен подбор наиболее эффективного штамма-продуцента, а также оптимальных условий культивирования клеток для получения антигенов прототипа вакцины в количествах достаточных для характеристики препарата и опытах на лабораторных животных. Для экспрессии рекомбинантных белков использовали клетки штамма E. coli SG13009. Для экспрессии белка mrPA3+4 культуры выращивали в течение 4 ч при +37°C и 180 rpm. Для экспрессии белков mrPA1+2 и mrPA83 культуры выращивали в течение 4-6 ч при 20°C и 180 rpm. После индукции клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 5000g и хранили при -20°C до использования. 3. Рекомбинантные белки выделены и очищены методом металл-аффинной хромотографии на Ni-NTA-агарозе (Qiagen, Германия) согласно протоколу «The QIAexpressionist» фирмы QIAGEN (Германия). Выход рекомбинантных белков составил 12–23 мг на 1л культуральной среды. Всего выделено 30 мг очищенного белка mrPA, 27 мг белка mrPA1+2 и 22 мг белка mrPA3+4. Все белки получены в количествах достаточных для проведения экспериментов на лабораторных животных в 2022 году. Полученные белки проанализированы и охарактеризованы с помощью методов спектрофотометрии и электрофореза в полиакриламидном геле. Молекулярные массы белков mrPA3+4, mrPA1+2 и mrPA83, рассчитанные по аминокислотной последовательности с помощью ProtParam EXPaSy (Швейцарский институт биоинформатики, http://expasy.org/), составили 30 кДа, 56 кДа и 84 кДа соответственно, что соответствует результатам анализа ДСН-ПААГ. При электрофорезе в ПААГ в неденатурирующих условиях появления белков с более высокой электрофоретической подвижностью, чем mrPA83, mrPA1+2 и mrPA3+4 не детектировали, что свидетельствует об отсутствии агрегации белков. Примеси эндотоксинов в растворах белков определяли с помощью хромогенного ЛАЛ-теста по конечной точке (Hycult Biotech, Нидерланды) в соответствии с протоколом производителя. Полученные образцы белков содержали примесь эндотоксинов менее 25 EU на 1 мг белка, что свидетельствует о высоком качестве препаратов рекомбинантных белков. Проведена оценка стабильности каждого модифицированного рекомбинантного антигена сибирской язвы при хранении в различных температурных условиях с последующим электрофоретическим анализом. mrPA83 оставался стабильным после 144 дней инкубации при +4°C. Напротив, немодифицированный rPA83, инкубированный при той же температуре, подвергался относительно быстрой деградации и полноразмерная форма не детектировалась вообще после 14 дней инкубации, а также набор белков с более высокой электрофоретической подвижностью, чем rPA83, изменялся в образцах в процессе инкубации. Таким образом, модификации mrPA83 привели к значительной стабилизации белка по сравнению с немодифицированным rPA83 при +4°C, что является обычной температурой хранения вакцин.В ходе выполнения Проекта 2018. было показано, что mrPA3+4 стабилен при +25°C не менее 16 дней. Мы продолжили оценку его стабильности и показали, что mrPA3+4 остается стабильным даже после 160 дней инкубации при +25°C. mrPA1+2 показал аналогичную стабильность: после 160 дней инкубации при +25°C основная полоса, выявленная при анализе электрофорезом соответствовала недеградированному белку. Для mrPA3+4 также была продемонстрирована стабильность в течение 21 дня при +37°C, что было использовано для моделирования ускоренного старения белка. 4. Получены антисыворотки к каждому из очищенных рекомбинантных белков. Для получения антисывороток мышей линии BALB/c иммунизировали mrPA1+2, mrPA3+4 и mrPA83 в присутствии адъюванта. Для всех групп мышей проводили трехкратную иммунизацию с двухнедельным интервалом. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор по аналогичной схеме с полным и неполным адъювантом Фрейнда. Кровь для антисыворотки брали на седьмой день после последней иммунизации и хранили при - 200. 5. Методом Вестерн-блот анализа исследована антигенная специфичность полученных белков. Вестерн-блот анализ проводили с использованием полученных мышиных антисывороток, в том числе ранее полученной (в ходе выполнения 1 этапа Проекта 2018) антисыворотки к немодифицированному РА83, а также коммерческой поликлональной антисывороткой к РА (Goat anti-PA, ListLabs, США) и рекомбинантными химерными моноклональными антителами к PA с нейтрализующей активностью (Panina et al., 2011). Как и ожидалось, mrPA83, mrPA1+2, mrPA3+4 эффективно взаимодействовали с полученными к ним антисыворотками, но главное, что все модифицированные антигены также эффективно реагировали с поликлональной антисывороткой к немодифицированному rPA 83. mrPA83 и mrPA3+4 также реагировали с рекомбинантными химерными моноклональными антителами к РА, обладающими нейтрализующей активностью. Распознавание белков с более высокой электрофоретической подвижностью в образцах рекомбинантных белков как поликлональной антисывороткой, так и моноклональными антителами не наблюдалось, также, как и реакции с лизатом клеток E. coli (отрицательный контроль). Это доказывает, что анализируемые белки являются антигенно активными фрагментами rPA. Более того, в положительном контрольном образце с немодифицированным рекомбинантным PA63 (rPA63) преобладали деградированные формы белка. Напротив, в каждом из модифицированных образцов rPA преобладали полноразмерные формы, что указывает на их относительно более высокую стабильность. 6. Методом термической перестройки из вирионов ВТМ (накопленных и очищенных при выполнении Проекта 2018) получены частицы сферической формы (СЧ). СЧ охарактеризованы методом электронной микроскопии и методом анализа траекторий наночастиц. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) показано, что полученные частицы по своей морфологии имеют форму сферы и рассчитано среднее значение диаметра СЧ при помощи при помощи программы «ImageJ» (Национальный Институт Здоровья, США) – 478±99 нм. Для изучения размеров СЧ в жидкости, а также для определения их агрегационного состояния был использован метод анализа траекторий наночастиц (NTA). Данный метод оценивает степень агрегации в жидкости, что позволяет избежать погрешностей связанных с влиянием высушивания образца на подложке и, таким образом, комбинация двух методов (ТЭМ и NTA) позволяет получить максимально достоверные результаты. Средний размер СЧ ± стандартное отклонение, рассчитанный по результатам всех измерений методом NTA составил 493±76 нм. Это значение согласуется с данными, полученными при анализе методом электронной микроскопии, что свидетельствует о том, что в жидкости не происходит агрегации СЧ. Всего получено 350 мг СЧ ВТМ. 7. Рекомбинантные белки были адсорбированы на поверхности СЧ. Было получено два типа комплексов: (1) СЧ, на поверхности которых адсорбирован один модифицированный антиген – mrPA83, mrPA1+2 или mrPA3+4; (2) комплексы, полученные путем адсорбции на поверхности СЧ одновременно двух белков– mrPA1+2 и mrPA3+4. Комплексы СЧ-mrРА83, СЧ- mrPA1+2 и СЧ- mrPA3+4 (с отдельной посадкой антигена) были при инкубации СЧ с белком в массовом соотношении 10:1, на 100 мкг СЧ – 10 мкг антигена. Все три комплекса были получены в PBS, который является приемлемым буфером для вакцинных препаратов. Для изучения возможности одновременной адсорбции двух антигенов на поверхности СЧ, белки mrPA1+2 и mrPA3+4 были помечены флуоресцентными красителями – изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) и изотиоцианатом родамина (RITC) соответственно. Композиции СЧ-mrPA1+2FITC + rPA3+4 RITC получены в PBS при следующем массовом соотношении соответствующих ингредиентов – 20:1:1, что соответствовало соотношению 10:1 СЧ/смесь двух антигенов Сравнение изображений препарата, полученных в режиме флуоресцентной визуализации в каналах FITC или RITC и в режиме фазовового контраста продемонстрировало, что контуры частиц на всех трех изображениях полностью коррелируют. Это свидетельствует о том, что белки mrPA1+2 и mrPA3+4 способны одновременно покрывать поверхность CЧ. Флуоресценция в областях, не соответствующих положению СЧ, детектируемому в режиме фазовогоконтраста не наблюдалась, что позволяет сделать вывод, что агрегаты свободного рекомбинантного белка в образце отсутствуют. Таким образом, получено два типа комплексов: (1) СЧ, на поверхности которых сорбирован только один из трех рекомбинантных белков – mrPA83, mrPA1+2 или mrPA3+4; (2) комплексы, полученные путем адсорбции на поверхности СЧ двух белков– mrPA1+2 и mrPA3+4. Одновременная адсорбция mrPA1+2 и mrPA3+4 на СЧ - это подход к разработке современных рекомбинантных вакцин, который является альтернативой использованию полноразмерных rPA. 8. Полученные комплексы СЧ-mrРА83, СЧ-mrPA1+2, СЧ-mrPA3+4 и СЧ-mrPA1+2-mrPA3+4 были охарактеризованы широким спектром физико-химических и иммунологических методов (просвечивающая электронная микроскопия, метод анализа траекторий наночастиц, электрофоретический анализ, иммунофлуоресцентная микроскопия). С помощью метода ТЭМ был проведен сравнительный анализ СЧ свободных от рекомбинантных белков и композиций СЧ-антигены. Показано, что СЧ после образования комплекса с рекомбинантными белками в PBS не меняют свою морфологию и средний размер (~484±99 нм) так как белки, расположенные на поверхности СЧ не вносят суммарного вклада в размеры частиц, которые могут быть детектированы методом ТЭМ. Следует отметить, что при исследовании препарата с помощью электронного микроскопа агрегаты свободного белка не были зафиксированы. Для изучения размеров и агрегационного состояния композиций СЧ-антиген(ы) в жидкости также был использован метод анализа траекторий наночастиц. Размер композиций СЧ-антиген(ы) по данным NTA был также сопоставим с размерами СЧ и составил 495±85 нм, при этом агрегации частиц не происходит, что свидетельствует о высокой стабильности полученных препаратов в физиологических условиях. Агрегационное состояние – важный фактор при создании фармакологических препаратов, в том числе вакцин. Эффективность адсорбции рекомбинантных белков – антигенов сибирской язвы на поверхности СЧ и антигенную специфичность каждого из используемых рекомбинантных антигенов в составе комплексов с СЧ анализировали методом непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии, как описано ранее (Karpova et al., 2012; Trifonova et al., 2017). В качестве первичных антител были использованы, полученные в ходе выполнения Проекта мышиные поликлональные антисыворотки к mrPA83, mrPA1+2 и mrPA3+4. В качестве вторичных антител использовали поликлональные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с Alexa Fluor® 546 (A-11030, Invitrogen, США). Анализ препаратов, одновременно с помощью флуоресцентной микроскопии и метода фазового контраста демонстрирует, что все СЧ связаны с молекулами целевых белков и сохраняют свою специфическую активность, при этом агрегаты свободных антигенов не обнаружены. Дополнительно для композиций СЧ-mrPA83m и СЧ-mrPA3+4 была изучена возможность распознавания моноклональными нейтрализующими антителами к протективному антигену. Для визуализации использовали видоспецифичные вторичные антитела, конъюгированные с CF™ 488A (SAB4600055, Sigma-Aldrich, Германия). Наличие флуоресцентного сигнала, соответствующего расположению СЧ свидетельствует о том, что нейтрализующий эпитоп доступен для взаимодействия с антителами в полученных композициях. Проведено сравнительное исследование стабильности индивидуальных модифицированных рекомбинантных антигенов сибирской язвы и их комплексов с СЧ при хранении. Образцы каждого отдельного антигена, а также образцы композиций СЧ-антиген были приготовлены в PBS и инкубированы при +37°C в течение 40 дней для моделирования ускоренного старения белков. Перед инкубацией и для каждой контрольной точки после инкубации отбирали образцы, содержащие равное количество антигена и анализировали в градиентном 8-20% ДСН-ПААГ. Показано, что в каждой контрольной точке стабильность каждого антигена сибирской язвы в составе композиций с СЧ была выше, чем стабильность соответствующего антигена при хранении в отсутствие СЧ. Таким образом, была продемонстрирована стабилизация модифицированных рекомбинантных антигенов сибирской язвы в составе комплексов с СЧ. Методом иммунофлуоресцентной микроскопии доказано сохранение антигенной специфичности всех трех модифицированных антигенов сибирской язвы после 40 дней инкубации в составе композиций с СЧ при +37°C. Все три антигена mrPA83, mrPA1+2 и mrPA3+4 оставались стабильными и сохраняли способность взаимодействовать с поликлональной антисывороткой к соответствующему антигену после хранения. Для композиций СЧ-mrPA83 и СЧ-mrPA3+4 также подтверждено сохранение доступности нейтрализующего эпитопа для распознавания моноклональными нейтрализующими антителами после 40 дней инкубации при +37°C. Таким образом, полученные комплексы СЧ-mrРА83, СЧ-mrPA1+2, СЧ-mrPA3+4 и СЧ-mrPA1+2-mrPA3+4 были охарактеризованы с помощью иммунологических и различных физико-химических методов (проанализированы морфология, размеры, агрегационное состояние, стабильность). Продемонстрирована более высокая стабильность модифицированных антигенов сибирской язвы mrPA1+2, mrPA3+4 и mrPA83 в комплексе с СЧ при хранении+37°C в течение 40 дней в отличие от индивидуальных белков.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Разработка прототипа вакцины против сибирской язвы на основе сферических частиц вируса табачной мозаики
Результаты этапа: Исследована иммуногенность кандидатных вакцинных препаратов на двух видах лабораторных животных (мыши, морские свинки). Оценен вклад СЧ ВТМ в стимуляцию иммунного ответа на протективный антиген в составе прототипа кандидатной вакцины. По нашим данным соотношение выработки антител к СЧ и модельным белкам может варьировать в зависимости от размера и состава рекомбинантного белка – антигена. Поэтому оценка вклада платформы-адъюванта при выработке антител в ответ на иммунизацию в данном случае необходима, несмотря на результаты с другими рекомбинантными белками, полученными в Проекте 2018. Поэтому сыворотки, полученные после иммунизации, проанализированы с целью выяснения соотношения антител, вырабатываемых на модифицированные антигены B. anthracis и на СЧ ВТМ. Специфическая активность сывороток иммунизированных животных исследована методом иммуноферментного анализа. В результате проведенных экспериментов проведена оценка иммуногенных свойств препаратов кандидатной вакцины: определены титры антител в процессе развития иммунного ответа на введение препарата и оценен вклад СЧ-ВТМ в стимуляцию иммунного ответа. На модели лабораторных животных (мышей, морских свинок) на базе ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск) исследована протективная эффективность кандидатных вакцинных препаратов на основе mrPA и СЧ. Для подтверждения протективного эффекта проведены эксперименты по выживаемости вакцинированных животных после заражения вирулентным штаммом B. anthracis. Протективная активность вакцинных препаратов оценена после однократной и двухкратной иммунизации лабораторных животных. Наблюдение за животными проводилось в течение 4 недель после заражения. Для оценки стабильности кандидатных вакцинных препаратов протективная эффективность оценена после хранения mrPA на СЧ, по крайней мере, в течение 3 месяцев при температуре +40 и +250С. Проведено сравнительное исследование протективной эффективности со свежеприготовленными препаратами. После хранения и оценки протективности отобран наиболее эффективный препарат. Проведены предварительные эксперименты по изучению токсичности кандидатной вакцины на животной модели. Проведена оценка воздействия вакцины на основные физиологические показатели лабораторных животных.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".