ИСТИНА

Проект направлен на решение проблемы по компьютерному дизайну флуоресцентных индикаторов и биомаркеров с улучшенными фотофизическими свойствами для изучения внутриклеточной передачи сигналов и молекулярного биоимиджинга при одно- и двухфотонном возбуждении. Целью проекта является установление основных факторов, влияющих на форму и положение спектров поглощения флуоресцентных меток и зондов при линейном и нелинейном возбуждении в различном окружении, а также оптимизация их фотофизических свойств для биотехнологических и биомедицинских приложений. Разработка флуоресцентных меток и зондов с улучшенными фотофизическими свойствами является актуальной задачей, позволяющей получить флуорофоры с большими квантовыми выходами флуоресценции, улучшенной яркостью, сдвинутыми в красную сторону спектрами поглощения и испускания. Исследование флуоресцентных меток и зондов с помощью методов квантовой химии высокого уровня точности позволит получить исчерпывающую информацию об их линейных и нелинейных фотофизических свойствах. Необходимо отметить, что моделирование спектров поглощения в реальном окружении – нетривиальная и до конца не решенная задача из-за наличия неоднородного уширения спектров как за счет окружения, так и конформационной подвижности флуорофоров. В связи с этим в ходе реализации проекта будет впервые развит комплексный подход, объединяющий методы молекулярной динамики, квантовой химии и различные вибронные модели для моделирования как однородного, так и неоднородного уширения спектральных полос. Успешная реализация проекта позволит не только предсказывать спектральные характеристики флуоресцентных меток и зондов в различном окружении, но и оптимизировать их свойства для биомедицинских приложений, в том числе для конфокальной и двухфотонной сканирующей микроскопии. В проекте будут решены следующие задачи: (1) развитие комбинированного подхода, сочетающего в себе методы термодинамического интегрирования с использованием молекулярной динамики, методов квантовой химии высокого уровня точности, а также различных вибронных моделей для моделирования формы полос в спектрах поглощения с учетом однородного и неоднородного уширения при одно- и двухфотонном возбуждении флуорофоров в реальном окружении; (2) анализ структуры и ширины вибронных полос в электронно-колебательных спектрах внутриклеточного кальциевого индикатора на основе флуоресцентного красителя Fura-2 и его модифицированных аналогов в водном растворе при однофотонном и двухфотонном возбуждении в различных условиях и оценка перспективности использования этого индикатора в условиях нелинейного возбуждения; (3) моделирование спектров однофотонного и двухфотонного поглощения биомаркеров на основе флуоресцентных белков с учетом гомогенного и негомогенного уширения и поиск путей оптимизации их нелинейных фотофизических свойств с помощью модификаций отдельных аминокислотных остатков в ближайшем окружении хромофорной группы с целью увеличения сечения двухфотонного поглощения. Масштаб и комплексность проекта обусловлены универсальностью разрабатываемых подходов и методов для моделирования линейных и нелинейных фотофизических свойств молекулярных систем в реальном окружении, а также ее междисциплинарностью – результаты будут получены на стыке химии, физики и биологии коллективом молодых ученых из разных областей, которые объединятся в рамках проекта для решения поставленных задач.

The project is aimed at computational design of the fluorescent indicators and biomarkers with improved photophysical properties for the study of intracellular signaling and molecular bioimaging under one- and two-photon excitation. The aim of the project is to identify the main factors affecting the shape and position of the absorption spectra of fluorescent tags and probes under linear and nonlinear excitation in various environments, as well as to optimize their photophysical properties for biotechnological and biomedical applications. The development of fluorescent tags and probes with improved photophysical properties is an important problem, which aims at obtaining fluorophores with high fluorescence quantum yields, improved brightness, and red-shifted absorption and emission spectra. The study of fluorescent labels and probes using high-level quantum chemistry methods will provide comprehensive information about their linear and nonlinear photophysical properties. It should be noted that modeling absorption spectra in a real environment is a nontrivial and not completely solved problem due to the presence of inhomogeneous broadening of the spectra caused by both the environment and the conformational flexibility of fluorophores. In this regard, an integrated approach will be developed for the first time within this project, combining methods of molecular dynamics, quantum chemistry and various vibronic models for modeling both homogeneous and inhomogeneous broadening of spectral bands. Successful implementation of the project will allow not only predicting the spectral characteristics of fluorescent labels and probes in various environments, but also optimizing their properties for biomedical applications, including confocal and two-photon scanning microscopy. The following tasks will be solved within the project: (1) development of a combined approach that involves thermodynamic integration methods using molecular dynamics, high-level quantum chemistry methods, as well as various vibronic models for modeling the band shapes in absorption spectra taking into account homogeneous and inhomogeneous broadening with one- and two-photon excitation of fluorophores in a real environment; (2) analysis of the structure and width of vibronic bands in the absorption spectra of an intracellular calcium indicator based on the fluorescent dye Fura-2 and its modified analogs in an aqueous solution under one-photon and two-photon excitation under various conditions and an assessment of the prospects of using this indicator under nonlinear excitation conditions; (3) modeling the spectra of one-photon and two-photon absorption of biomarkers based on fluorescent proteins, taking into account homogeneous and inhomogeneous broadening, and searching for ways to optimize their nonlinear photophysical properties by modifying individual amino acid residues in the immediate environment of the chromophore group in order to increase the cross section of two-photon absorption. The scale and complexity of the project are defined by the versatility of the developed approaches and methods for modeling linear and nonlinear photophysical properties of molecular systems in a real environment, as well as by its interdisciplinarity - the results will be obtained at the intersection of chemistry, physics and biology by a team of young scientists from different fields, who will be united within the framework of the project for implementing it in a most successful manner.

1. Будет создан программный комплекс для моделирования спектров однофотонного и двухфотонного поглощения флуоресцентных меток и зондов в растворе и белковом окружении с учетом однородного и неоднородного спектрального уширения. 2. Будет разработана методика моделирования структуры и фотофизических свойств полианионных комплексообразующих красителей в растворе на примере флуоресцентного индикатора Fura-2, с помощью которого можно изучать осцилляции внутриклеточной концентрации ионов кальция в тромбоцитах, что дает информацию о процессах сигнализации в клетках. 3. Будут установлены основные факторы, влияющие на форму и положение полос в спектрах однофотонного поглощения кальциевого индикатора Fura-2, выявлены вклады однородного и неоднородного уширения в различных условиях (pH и другие ионы в растворе), а также объяснена природа сдвига максимумов поглощения при связывании ионов кальция. 4. Будут установлены основные факторы, влияющие на форму и положение полос в спектрах двухфотонного поглощения кальциевого индикатора Fura-2 и проведена оценка перспективности использования Fura-2 в условиях нелинейного возбуждения, а также будут предложены пути по увеличению сечения двухфотонного поглощения с помощью введения в его структуру различных функциональных групп. Двухфотонное возбуждение позволит проводить непрерывное изучение динамики внутриклеточной концентрации ионов кальция в течение продолжительного времени. 5. Будут предложены способы оптимизации нелинейных фотофизических свойств биомаркеров на основе флуоресцентных белков семейства GFP с помощью модификаций отдельных аминокислотных остатков в ближайшем окружении хромофорной группы для их применения во флуоресцентной микроскопии с двухфотонным возбуждением.

Руководитель проекта обладает большим опытом в области разработки методов моделирования электронно-колебательных спектров больших атомно-молекулярных систем с явным учетом влияния окружения. В частности, руководителем проекта были разработаны следующие методы и модели: 1. Разработан теоретический подход, позволяющий выявлять термодинамически стабильные подсистемы большого канонического ансамбля на основе данных молекулярного моделирования. 2. На основе вибронной модели Лакса и подходов термодинамического интегрирования при помощи молекулярной динамики реализован способ расчета форм полос электронных спектров поглощения. 3. Предложена многомасштабная модель, позволяющая на базе неэмпирических парных потенциалов моделировать термодинамические процессы и процессы электронного возбуждения в молекулярных и атомных ассоциатах, содержащих тысячи атомов. Руководитель проекта также принимал активное участие в изучении процессов релаксации возбужденных состояний депротонированного хромофора зеленого флуоресцентного белка в растворе при линейном и нелинейном возбуждении, приводящих к фотоионизации молекулярного аниона. Предложена методика оценки вертикальной энергии фотоионизации заряженных хромофоров в водном окружении, основанная на разработанном гибридном подходе квантовой химии и молекулярной динамики, которая позволяет исследовать системы большого размера с явным учетом вплоть до 19,000 молекул воды. Профессиональный опыт и знания Клещиной Н.Н. в моделировании спектров электронного возбуждения для систем большого размера, а также ее практические навыки в программировании являются особо важными для реализации данного проекта.

Разработан комбинированный молекулярно-динамический и квантово-химический подход для моделирования формы и положения полос в спектрах однофотонного и двухфотонного поглощения хромофоров в реальном окружении с учетом однородного и неоднородного уширения. Для работы с большим числом конфигураций при усреднении вдоль молекулярно-динамической траектории реализована серия автоматизированных протоколов, написанных на языке Python. Разработанный теоретический подход объединяет методы молекулярной динамики, вибронные модели, методы квантовой химии высокого уровня точности, такие как расширенная многоконфигурационная квазивырожденная теория возмущений второго порядка XMCQDPT2 и комбинированные методы квантовой и молекулярной механики КМ/ММ на ее основе. Сечения двухфотонного поглощения рассчитываются с использованием N-уровневой модели с явным суммированием по промежуточным состояниям. Параметры для расчета сечений получены с помощью метода XMCQDPT2 в сочетании с методом потенциалов эффективных фрагментов для моделирования влияния эффектов растворителя. С использованием разработанного подхода установлены основные факторы, влияющие на форму и положение полос в спектрах поглощения кальциевого индикатора Fura-2 в водном растворе в свободной форме и в комплексе с ионом кальция при однофотонном и двухфотонном возбуждении. Полученные спектры однофотонного и двухфотонного поглощения флуоресцентного красителя Fura-2 хорошо согласуются с экспериментальными данными. Стоит отметить, что формы спектров при однофотонном и двухфотонном возбуждении в случае конформационно нежесткого красителя Fura-2 похожи, что говорит о доминирующем вкладе неоднородного уширения. С использованием разработанного подхода проведено моделирование спектров однофотонного и двухфотонного поглощения биомаркеров на основе флуоресцентных белков семейства GFP и проведен поиск путей оптимизации их нелинейных фотофизических свойств с помощью модификаций отдельных аминокислотных остатков в ближайшем окружении хромофорной группы с целью увеличения сечения двухфотонного поглощения. Установлено, что модификация T203I в белке EGFP приводит к частичному разрушению сетки водородных связей хромофора и его ближайшего окружения и возникновению существенной конформационной подвижности активного центра; при этом сечение двухфотонного поглощения белка сильно зависит от структуры активного центра и варьируется в широких пределах. Показано, что увеличение сечения двухфотонного поглощения EGFP может быть достигнуто путем модификации белкового окружения хромофора при введении точечных мутаций, влияющих на электростатическое поле белка вблизи хромофора. Увеличению сечения отвечает усиление напряженности электрического поля вдоль направления от фенольного кольца хромофора к имидазолоновому, противоположному направлению вектора изменения постоянного дипольного момента при возбуждении, которое может быть достигнуто, например, изменением заряда окружения фенольного кольца хромофора на более положительный, а имидазолонового – на более отрицательный. Полученные результаты подтверждаются экспериментальными данными. По результатам проекта подготовлены 3 статьи, а также представлено 12 докладов на международных и всероссийских конференциях. Работы молодых исполнителей проекта отмечены дипломами конференций. По результатам, полученным в рамках проекта, защищены 2 дипломные работы студентов химического и физического факультетов МГУ.