![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Посттрансляционные модификации белков могут влиять на их активность, структуру, взаимодействие с другими молекулами, стабильность и локализацию. Среди различных типов посттрансляционных модификаций уникальной является олигоглютамилирование рибосомного белка S6 некоторых бактерий, в том числе, E. coli. В ходе предварительных исследований в нашей лаборатории было установлено, что отсутствие фермента, проводящего модификацию S6, RimK, приводит к гиперчувствительности бактерий к окислительному стрессу и может быть супрессировано спонтанной мутацией в гене, кодирующем сигма70 субъединицу РНК полимеразы. Хотя взаимодействие рибосомы и РНК полимеразы в клетках бактерий известно, совершенно не известна роль в этом взаимодействии модифицированных компонентов рибосомы. Цель данного проекта разобраться в механизме прямого или опосредованного взаимодействия рибосомы и РНК полимеразы при участии модификации рибосомного белка S6.
В результате выполнения проекта будет изучен новый механизм взаимодействия (прямого или опосредованного) модифицированной по белку S6 рибосомы и РНК полимеразы. В первый год выполнения проекта планируется получить штаммы, в которых будут вместе и по-отдельности инактивирован ген rimK и присутствовать мутация rpoD (сигма70). Будут выявлены условия, в которых мутация rpoD дает преимущество в выживании штамма, лишенного rimK и, следовательно, не имеющего возможности модифицировать S6. Будут определены белки, эффективность и, возможно, точность синтеза которых зависит от модификации S6 и мутации в rpoD. Также будут определены изменения, происходящие с транскрипцией генов при отсутствии модификации S6 и при наличии мутации rpoD (вместе и по-отдельности).
В нашей лаборатории исследовалась функциональная роль модификации рибосомного белка S6 E. coli. Нами впервые было показано, что субстратом фермента RimK служит S6 в составе собранной рибосомы, а не свободный белок S6. Кроме того, было показано, что модификация проходит только в стационарной фазе роста. Эти данные свидетельствовали в пользу регуляторного значения модификации белка S6.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 17 февраля 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Функциональная роль необычной модификации (олигоглютамилирования) рибосомного белка S6 E. coli |
Результаты этапа: Создание штаммов E.coli, несущих мутации в генах rimK и rpoD На первом этапе выполнения проекта перед нами встала задача создания штаммов E. coli, которые помогли бы нам дифференцировать эффекты от делеции гена rimK и мутации в гене, кодирующем сигма-субъединицу РНК-полимеразы (rpoD). При помощи ?-RED системы и P1-трансдукции мы получили 4 штамма, представляющие все возможные комбинации мутантных и нативных генов rimK и rpoD. Для создания подобной коллекции штаммов мы ввели ген устойчивости к хлорамфениколу в каждый их них, таким образом, чтобы встраивание происходило в «пустой» участок генома, который не являлся бы кодирующим или регуляторным. В полученных штаммах, содержащих делецию rimK, мы дополнительно удалили ген устойчивости к канамицину, чтобы свести к минимуму возможность изучения побочных эффектов, которые могли бы быть вызваны наличием кассеты с геном устойчивости в опероне, кодирующем RimK. Все штаммы были охарактеризованы при помощи секвенирования соответствующих локусов генома, а также иммуноблотом для подтверждения отсутствия модификации белка S6. Сравнение штаммов с делецией гена rimK и мутацией в гене rpoD Для проверки различия фенотипов коллекции штаммов мы измерили скорость их роста в богатой среде. Из кривых роста явно видно различное поведение штаммов с мутацией в гене rpoD и остальных штаммов. Штамм с мутацией rpoD заметно позже выходит из стационарной фазы и пребывает в лаг-фазе роста на 20-30 минут дольше контрольных штаммов. Важно отметить, что штамм с делецией гена rimK не отличается скоростью роста и выхода из стационарной фазы от штамма дикого типа. Подобное различие в скорости выхода из стационарной фазы может быть обусловлено именно различием в эффективности аппарата биосинтеза белка. Для проверки уровня синтеза белка в стационарной фазе мы применили метод de novo трансляции, позволяющий охарактеризовать уровень новосинтезированного белка в интересующий нас момент времени. В определенный момент времени к клеткам, растущим на бедной среде с аминокислотами, но без метионина добавляли гомопропаргил глицин. Из клеток выделяли суммарный белок и проводили реакцию азид-алкинового циклоприсоединения с красителем Cy3. С помощью гель-электрофореза оценивали интенсивность биосинтеза белка в стационарной фазе. Видно, что в стационарной фазе трансляция в штаммах дикого типа и ?rimK заметно снижена, в то время как в штаммах с мутантной сигма-субъединицей трансляция заметно выше. Таким образом, мы достоверно показали, что влияние на трансляцию в стационарной фазе оказывает именно мутация в гене rpoD, а не делеция гена rimK. Далее мы решили проверить, может повышенная трансляция в стационарной фазе быть вызвана увеличением какого-то специфического белка? Для этого мы изучили протеомный состав клеток в стационарной фазе. Мы выдели суммарный белок из клеток дикого типа и мутантных штаммов, белки дифференциально пометили красителями Cy2 и Cy5 и провели двумерный дифференциальный гель-электрофорез. Оказалось, что повышение уровня трансляции в стационарной фазе у штамма с мутированным геном rpoD наблюдается для всех клеточных белков, особенно белков большой молекулярной массы и нельзя выявить какие-то специфично изменяющиеся белки. Влияние олигоглутамилирования рибосомного белка S6 на процесс трансляции E. coli Для изучения влияния модификации белка S6 на клетку E.coli мы провели сравнение протеомного состава клеток на всех стадиях роста. Из данных экспериментов видно, что отсутствие модификации белка S6 не приводит к заметному изменению протеома клетки в проверенных нами условиях. Поиск фенотипа штамма ?rimK Для изучения влияние гена rimK на жизнедеятельность клеток мы провели исследование устойчивости клеток дикого типа и клеток с делецией гена rimK к различным стрессам. Значимых различий между штаммом с инактивированным геном rimK и штаммом сравнения мы не обнаружили. Также мы решили проверить, может наличие модификации как-то влияет на состав рибосом в стационарной фазе? Для этого мы выделили рибосомы из клеток, находящихся в стационарной фазе и проанализировали их методом MALDI-TOF. Из спектров видно, что состав рибосом не отличается в штамме дикого типа и в штамме с нокаутом по гену rimK. Поскольку высока вероятность того, что данная модификация является регуляторной (из-за того, что сама она регулируется фазой роста культуры) мы решили попробовать индуцировать ее появление антибиотиками, влияющими на трансляцию и проверить ее наличие в штаммах с делецией генов, связанных со стационарной фазой, голодом и стрессом. К сожалению, нам не удалось найти условия, в которых наблюдалась бы индукция данной модификации в логарифмической фазе или наоборот, модификация отсутствовала бы в стационарной фазе. Поиск возможных мишеней посттрансляционной модификации компонентов системы биосинтеза белка В ходе изучения модификации, осуществляемой ферментом RimK, мы предположили, что у фермента может существовать несколько мишеней. Данное предположение основывалось на том, что в непосредственной близости от C-конца белка S6 находится сайт связывания C-конца фактора гибернации yfiA. Особенно интересным является тот факт, что C-концевой пептид данного фактора (EEVEEE) схож с C-концевым пептидом белка S6 (EAGDSEE), который подвергается модификации (добавлению остатков глютаминовой кислоты) белком RimK. Для проверки данного предположение мы создали конструкцию для суперэкспрессии белка YfiA с аффинным тагом на N-конце белка. Клетки с индуцированным синтезом YfiA выращивали в течение нескольких дней, выделяли белок и анализировали его методом MALDI-TOF. При инкубации клеток в длительной стационарной фазе (от 48 часов) можно наблюдать наличие дополнительных пиков белка, которые соответствуют массе белка и дополнительным одной и двум глютаминовым кислотам. Посттрансляционная модификация белка EF-Tu В ходе протеомных исследований в нашей лаборатории мы обнаружили, что RimI ацилирует не только рибосомный белок S18, но и элонгационный фактор EF-Tu. Для проверки влияния модификации на стабильность EF-Tu мы создали конструкцию для суперэкспрессии белка EF-Tu с аффинным тагом на С-конце. Мы индуцировали синтез белка в ранней логарифмической фазе, после чего отмыли клетки от индуктора ангидротетрациклина и отбирали образцы клеток через определенные временные интервалы. Анализировали стабильность EF-Tu-His6 методом иммуноблотинга. Оказались, что количество EF-Tu быстрее уменьшалось в штамме ?rimI, в котором EF-Tu деацилирован. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Функциональная роль необычной модификации (олигоглютамилирования) рибосомного белка S6 E. coli |
Результаты этапа: Основная цель проекта – исследование необычной модификации рибосомного белка S6 E. coli глютамил-трансферазой RimK. Ранее мы показали, что модификация S6 происходит в стационарной фазе. Исследуя фенотип инактивации rimK, мы обнаружили, что delta rimK штамм несет вторичную мутацию в гене rpoD. В ходе исследования мы создали штаммы, в которых были воссозданы независимо все возможные сочетания мутаций в rimK и rpoD. Мы показали, что наиболее яркие фенотипические проявления связаны именно с мутацией rpoD, а не rimK. Мы также обнаружили вторую мишень RimK, фактор гибернации YfiA. Для того, чтобы понять роль модификации YfiA мы создали конструкцию для экспрессии и выделили этот белок. Для изучения того, как модификация влияет на взаимодействия с партнерами YfiA мы получили и проверили антитела против YfiA. Кроме изучения функциональной роли RimK мы начали исследование роли другой, случайно открытой нами модификации, ацетилирования фактора элонгации трансляции EF-Tu белком RimI. Мы проверили, как модификация EF-Tu влияет на его стабильность и функциональную активность (биосинтез белка) in vivo. Значимого влияния на стабильность и активность EF-Tu модификация не оказывает. | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Функциональная роль необычной модификации (олигоглютамилирования) рибосомного белка S6 E. coli |
Результаты этапа: В 2018 году выявлена роль мутантного гена rpoD в гибернации клеток, транскрипции генов рРНК и других генов.Определена роль rpoD в повышении доли ампициллин-чувствительных (метаболически активных)клеток по отношению к ампициллин устойчивым (покоящимся). |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".