Исследование цинк-зависимых механизмов нейродегенерации сетчаткиНИР

Investigation of zinc-dependent mechanisms of retinal neurodegeneration

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 20 апреля 2021 г.-31 декабря 2021 г. Исследование цинк-зависимых механизмов нейродегенерации сетчатки
Результаты этапа: В 2021 году с использованием когорты пациентов, получавших хирургическое лечение в НМИЦ ГБ имени Гельмгольца, предпринята попытка охарактеризовать механизмы цинкзависимой нейродегенерации сетчатки при первичной открытоугольной глаукоме (ПОУГ) путем комплексного анализа изменений состава водянистой влаги (ВВ), которая обеспечивает питание и иммунитет тканей глаза, и нарушение циркуляции которой лежит в основе патогенеза этого заболевания. В проекте анализировались такие параметры ВВ пациентов, как общая концентрация цинка, содержание широкого спектра низкомолекулярных цинксвязывающих соединений (аминокислоты и родственные метаболиты, трикарбоновые кислоты, витамины, биогенные амины и др.), а также активность биохимических компонентов, относящихся к маркерам окислительного стресса и анитиоксидантой защиты, и содержание липидных медиаторов окислительного стресса и воспаления. Исследования проведены с помощью высокотехнологичных методик, включающих использование атомно-абсорбционной спектрометрии, ГХ-MC и ВЭЖХ-MС/MС, большинство из которых были оптимизированы для измерения параметров ВВ, имеющего ряд особенностей. Обработка полученных результатов выполнена с использованием современных методов статистического анализа. Для более детального изучения механизма нейродегенерации при глаукоме, включая определение взаимосвязей между выявленными изменениями в ВВ и развитием патологического процесса в сетчатке, разработана и оптимизирована модель этого заболевания, включающая индукцию стойкой внутриглазной гипертензии у животных (кроликов) путем введения метилцеллюлозы в переднюю камеру глаза. С помощью клинических, электрофизиологических и гистологических исследований осуществлена подробная характеристика патологических изменений в рамках разработанной модели – клинической картины развивающегося заболевания, включая изменение общего состояния глаза и нарушение электрофизиологической активности сетчатки, механизма индукции повышения ВГД, а также структуры повреждений вовлеченных тканей и компартментов глаза (диск зрительного нерва, сетчатка, передняя камера глаза, трабекулярная сеть). Для выявления корреляций между развитием модельной глаукомы и реального заболевания у пациентов произведены исследования биохимического состава ВВ экспериментальных животных, аналогичных таковым, выполненным для когорты пациентов с ПОУГ. С учетом результатов проведенных исследований и анализа литературных данных отобрано два потенциальных цинксвязывающих белка сетчатки и ВВ, ассоциированных с глаукомой. С применением современных методов структурной биоинформатики, включая КМ/ММ моделирование молекулярной динамики, предсказана структура цинксвязывающих сайтов в этих белках. С помощью физико-химических (инструментальных методов) изучены параметры комплексов этих белков с ионами цинка, а также исследовано влияние связывания цинка на их коформационные свойства, стабильность и склонность к агрегации. Отдельно следует отметить, что в проекте впервые исследовалась применимость оригинального подхода к диагностике ПОУГ с помощью регистрации термодинамических сигнатур слезной жидкости пациентов методом дифференциальной сканирующей флуориметрии с автоматизированной обработкой полученных данных методами искусственного интеллекта (машинного обучения).
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Исследование цинк-зависимых механизмов нейродегенерации сетчатки
Результаты этапа: В рамках исследования цинкзависимых механизмов дегенерации сетчатки завершена скрининговая часть работы, связанная с анализом образцов водянистой влаги (ВВ) пациентов с первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ). Биохимический состав ВВ является отражением секретома сетчатки, т.е. набора низкомолекулярных (металлы, липиды, аминокислоты, другие метаболиты) и высокомолекулярных (белки) соединений, секретируемых нейронами этой ткани. На предыдущем этапе проекта удалось показать, что развитие ПОУГ сопровождается повышением в ВВ пациентов общего содержания ионов цинка. В 2022 году, с применением “омиксных” подходов удалось выявить набор низкомолекулярных соединений, которые обладают собственной активностью (сигнальные молекулы, антиоксиданты и пр.), а также могут образовывать комплексы с цинком, тем самым регулируя его биодоступность и патологическую активность. Аналогичные исследования проведены с использованием животных моделей глаукомы и возрастной макулярной дегенерацией (ВМД), итогом которых стала демонстрация сходных биохимических изменений и механизмов, что позволило использовать указанные модели для исследования белков, таргетируемых мобильным цинком. Впервые осуществлен биохимический поиск, а также системный анализ подобных белков на основе структурного предсказания среди протеомов ВВ и сетчатки. Получены препараты отобранных белков, способных опосредовать цитотоксические эффекты цинка, и с помощью современных инструментальных методов всесторонне охарактеризованы их цинксвязывающие свойства. Это позволило классифицировать белки по функциональной активности и отобрать те из них, которые потенциально важны в контексте механизмов глаукомы и ВМД и таргетирование которых может иметь терапевтические перспективы.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Исследование цинк-зависимых механизмов нейродегенерации сетчатки
Результаты этапа: Завершен анализ цинксвязывающих свойств белков, ассоциированных с глаукомой и ВМД. Охарактеризована аффинность и стехиометрия комплексов, изучены эффекты цинка на вторичную структуру, конформацию, стабильность, олигомерный статус и склонность к агрегации этих белков. На основании полученных данных нейротропный фактор PEDF определен в качестве основной внеклеточной мишени цинка при глаукоме. С использованием животной модели глаукомы показано, что повышенная секреция PEDF характерна для нейропатии, вызванной глазной гипертензией. С использованием клеточных моделей сетчатки установлено, что в ответ на цинковый стресс наблюдается стимуляция секреции PEDF с одновременным ингибированием его активности. Охарактеризован общий механизм цинковой токсичности в отношении нейронов сетчатки с помощью секвенирования (RNA-seq) и анализа транскриптомов модельных клеток сетчатки. Показано, что ответ клеток включает (1) снижение экспрессии генов, связанных с ростом нейронов, (2) индукцию генов цинк-буферных белков и цинковых транспортеров, (3) индукцию генов молекулярных шаперонов и регуляторов реакции несвернутых белков, а также (4) индукцию генов MAPK-зависимых путей, регулирующих выживаемость клеток. При этом зафиксировано снижение или отсутствие изменений экспрессии генов, зависимых от PEDF, что подтверждает его ингибирование цинком. Показано, что уровень продукции мРНК PEDF не восполняется, что со временем будет приводить к его недостатку, усиливая общий цитотоксический эффект. Определен внутриклеточный сигнальный путь, способный опосредовать нейротоксическое действие цинка в сетчатке через ALDH1A1 – сигнальный фермент каскада RA, регулирующего экспрессию генов в сетчатке. Подъем ALDH1A1 предшествует апоптозу и ассоциируется с увеличением продукции RA, ее перераспределением из цитоплазмы в ядро и модуляцией RA-зависимых путей. Фенотип клеток с нокдауном гена этого фермента отличается устойчивостью к цинковому стрессу. В целом, ингибирование нейропротекторной активности PEDF и активация апоптозных ALDH1A1/RA-зависимых путей могут составлять общий механизм цитотоксичности цинка, который запускается снаружи и изнутри клетки и ингибирование которого может иметь нейропротекторный эффект в рамках перспективной терапии глаукомы и ВМД. С использованием моделей глаукомы и ВМД животных протестированы экспериментальные подходы к таргетированию описанных цитотоксических путей в сетчатке, основанных на хелатировании цинка с использованием N-ацетил-L-цистеина (NAC) и на компенсации цинк-индуцированного дефицита нейротропной активности PEDF. Терапия NAC не оказывает выраженного нейропротекторного действия, однако оказывает противовоспалительный эффект, вероятно за счет антиоксидантной активности соединения. В свою очередь интравитреальные инъекции PEDF в значительной степени предотвращает снижение электрофизиологической активности сетчатки при этих заболеваниях. В целом, эффективность экзогенного PEDF может снижаться в результате эффектов высокого цинка, характерного для глаукомы и ВМД, в связи с чем, для оптимизации терапии можно рекомендовать внесение изменений в структуру белка с целью снижения или блокирования его чувствительности к цинку.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".