ИСТИНА

Проект направлен на исследование принципов формирования, строения и свойств самоорганизующихся наноструктурированных микрогель-ферментных пленок и создание на их основе биосенсорных покрытий с регулируемой ферментативной активностью.

The project aims at investigating the principles of the formation, structure, and properties of self-assembling nanostructured microgel-enzyme films as well as at fabrication of biosensing coatings with regulated enzymatic activity, which are based on such films.

1. Будут охарактеризованы стимулчувствительные (рН- и термочувствительные) полимерные микрогели в водных средах (определены интервалы рН, в которых происходит изменение степени заряженности и значения рКа, а также температурные интервалы, в которых наблюдаются фазовый переход, и значения критических температур фазового перехода). 2. Будет выявлена роль степени сшивки и содержания ионогенных групп в микрогеле на структуру и свойства микрогелевых покрытий (топография поверхности, степень заполнения, шероховатость, смачиваемость и проч.). 3. Будет исследовано взаимодействие ферментов с оптимизированными микрогелевыми пленками с учетом роли структуры полимерного компонента и влияние на него условий окружающей среды, при которых проводится иммобилизация ферментов (рН, ионная сила, состав растворителя и проч.). 4. Будет проведен электрохимический анализ активностей иммобилизованных ферментов, получены аналитические характеристики и оценена устойчивость сенсорных откликов микрогель-ферментных покрытий. 5. Будет проведено сравнительное исследование возможности температурной регуляции ферментативной активности для различных моно- и биферментных микрогель-ферментных пленок, а также осуществлен систематический скрининг аналитических параметров биосенсорных покрытий на их основе.

Проект базируется на результатах успешного выполнения проектов РФФИ 14-08-01108, 17-08-01151 и 19-08-00483.

Проведено сравнительное изучение поведения стимулчувствительных микрогелей различного состава в водных средах. Для этого были использованы имеющиеся в распоряжении стимулчувствительные сополимерные микрогели: поли(изопропилакриламид-со-аминопропилметакриламид)ы (П(НИПАМ-со-АПМА)), содержащие различные мольные количества звеньев катионного сомономера (АПМА) и различные мольные количества сшивающего агента метиленбисакриламида (БИС), а также поли(изопропилакриламид-со-диметиламинопропилметакриламид) П(НИПАМ-со-ДМАПМА). Здесь и далее использованы кодовые обозначения образцов микрогелей, в которых цифрами обозначены мольные содержания соответствующего ионогенного сомономера и сшивающего агента. Протонирование микрогелей различного состава исследовали методом потенциометрического титрования. Полученные зависимости степени протонирования от pH указывают, что для образцов микрогелей, которые содержали в своем составе АПМА-сомономер, переход из полностью протонированного состояния в полностью депротонированное состояние наблюдается при изменении рН от 5 до 10,5. Характеристические значения pKa для таких микрогелей лежат в пределах 9,0 – 9,3. Аналогичный переход для микрогеля, содержащего в своем составе ДМАПМА-сомономер, наблюдался при изменении рН от 5,2 до 9,5. Характеристическое значение pKa для такого микрогеля составило 7,8. Полученные данные подтверждают более основные свойства первичных аминогрупп (АПМА) по сравнению с третичными (ДМАПМА). Для микрогелей 10АПМА-5БИС и 10ДМАПМА-5БИС методом лазерного микроэлектрофореза определены электрофоретические подвижности (дзета-потенциалы) при различных рН. В случае 10АПМА-5БИС полученные результаты хорошо согласовывались с данными потенциометрического титрования. В частности, при pH ≤ 6,0, сильно заряженные частицы 10АПМА-5БИС обладали электрофоретической подвижностью 1,5 (μм × см)/(В × с), а при повышении рН до 10,5 величина их электрофоретической подвижности понижалась до нуля. В отличие от 10АПМА-5БИС 10ДМАПМА-5БИС демонстрировал существенное уменьшение электрофоретической подвижности только при pH > 8, когда микрогель уже достаточно депротонирован. Термочувствительное поведение микрогелей различного состава в водных средах было охарактеризовано методом динамического светорассеяния. Термочувствительность выражалась в обратимом сжатии-набухании их частиц при циклическом изменении температуры выше или ниже температуры фазового перехода, сопровождающегося изменением объема (volume phase transition temperature (VPTT)). Полученные данные указывают на то, что повышение содержания катионного сомономера в микрогеле приводит к заметному сдвигу температуры фазового перехода в область более высоких значений при одновременном снижении способности микрогелей к изменению размеров под действием температуры. Это объясняется тем, что присутствие заряженных сомономерных звеньев в микрогелях не позволяет их частицам эффективно сжиматься под действием температуры, поскольку заряженные звенья АПМА или ДМАПМА отталкиваются друг от друга. Увеличение содержания сшивающего агента (при постоянном содержании ионогенного сомономера) также подавляет термочувствительность. Это связано с тем, что повышение содержания сшивающего агента увеличивает жесткость структуры, что также подавляет термочувствительность. Гидрофобизация микрогелей при повышении температуры приводит к агрегации их частиц, что отражается в повышении мутности их водных растворов. Агрегативное поведение 10АПМА-5БИС, 3АПМА-5БИС и 10ДМАПМА-5БИС при изменении температуры было подробно исследовано методом турбидиметрии. Обнаружено, что снижение степени протонирования микрогелей (по мере увеличения рН) способствует усилению процессов агрегации. Для 10АПМА-5БИС до рН 9,0, то есть когда степень протонирования этого микрогеля все еще остается достаточно высокой, наблюдаемые изменения обратимы. Нагревание водных растворов 10АПМА-5БИС при рН 9,5 и выше, то есть когда степень протонирования его частиц составляет менее 0,5, приводит к агрегации и утрате обратимости системой. Для 3АПМА-5БИС изменения мутности при повышении температуры оказываются еще более значительными: при всех значениях рН наблюдается достаточно сильный гистерезис (несовпадение кривых нагревания и охлаждения), а также после полного завершения цикла «нагревание-охлаждение» прозрачность растворов микрогеля полностью не восстанавливается. Это свидетельствует о необратимой агрегации его частиц при нагревании. Такое поведение связано с меньшим содержанием катионных сомономерных звеньев АПМА в образце 3АПМА-5БИС и, соответственно, с меньшим влиянием их электростатического отталкивания на термочувствительность микрогеля. Таким образом, уменьшение общего содержания сомономера АПМА (задается при синтезе), а также уменьшение степени заряженности микрогелей (задается значением рН) приводит к тому, что термочувствительность образцов усиливается. Адсорбцию микрогелей на поверхность покрытого тонким слоем золота кварцевого резонатора исследовали методом пьезоэлектрического микровзвешивания с мониторингом диссипации (ПЭМ-МД). Он позволяет в режиме реального времени следить за адсорбцией вещества на поверхность резонатора, измеряя изменения его частоты колебаний и диссипации. Полученные временные зависимости изменения частоты F и диссипации D при адсорбции микрогелей моделировали в рамках модели Фойгта для вязкоупругих тел, получая значения «влажных» масс адсорбированного вещества. Под «влажной» массой подразумевается суммарная масса адсорбированного вещества, связанной им воды и акустической воды. Эксперименты проводили при различных температурах и рН адсорбции. «Влажная» масса микрогелевой пленки в заданных условиях (Масса M1) зависела как от количества частиц микрогеля, связавшихся с поверхностью, так и от степени их набухания (которые задаются условиями адсорбции, то есть температурой и рН). Для разделения этих эффектов пленку приводили к «стандартным» условиям, за которые были выбраны температура 25 оС и/или рН 9,5, пропуская через проточную систему 10 мМ Трис при «стандартных» рН и температуре. Это позволяло получить «влажную» массу микрогелевой пленки в «стандартных» условиях (Масса M2). Наблюдаемое изменение «влажной» массы пленки при смене условий (сравнение М1 и М2) указывало на сохранение стимулчувствительных свойств микрогелей (рН и термочувствительности) в адсорбированном состоянии. Возврат к исходным значениям рН и температуры, при которых проводили адсорбцию, приводил к восстановлению исходной «влажной» массы пленки, что указывало на прочность взаимодействия микрогелей с поверхностью. Полученные значения «влажной» массы микрогелевой пленки указывают на то, что оптимальными условиями для достижения наиболее эффективной модификации микрогелем золотой поверхности кварцевого резонатора являются те, при которых его частицы существенно гидрофобизованы (высокие значения рН и повышенная температура). Полученные закономерности являются общими и для других микрогелей получены в целом схожие результаты. Устойчивость к десорбции адсорбированных микрогелей оценивали тем же методом при варьировании рН и концентрации низкомолекулярной соли (NaCl). Для этого микрогелевые пленки, сформированные в оптимальных условиях, подвергали воздействию более кислых рН (рН 7 или рН 3, которые приводили к заряжению микрогелей) или солевых сред (150 мМ или 500 мМ NaCl при рН 7, что приводило к экранированию электростатических взаимодействий), а затем возвращались к исходной среде. Такое воздействие повторяли в циклическом режиме три раза, фиксируя на каждой стадии изменения величин частоты F и диссипации D. Моделирование данных позволяло оценить изменения «влажной» массы микрогелевой пленки, вызываемое тем или иным воздействием. Показано, что скачкообразные циклические изменения рН вызывают обратимые изменения «влажной» массы пленки (за счет вызванного изменением рН набухания-обезвоживания адсорбированных частиц), при этом не наблюдается никакого значимого изменения «влажной» массы при каждом фиксированном значении рН. Полученные результаты демонстрируют отсутствие десорбции микрогелей, что указывает на необратимый характер их связывания с золотой поверхностью кварцевого резонатора за счет сильной многоточечной адгезии к поверхности. Кроме того, десорбция микрогелей не происходит также при воздействии на микрогелевую пленку растворами с повышенной ионной силой (150 мМ или 500 мМ NaCl), что предполагает неэлектростатический характер связывания микрогелей с поверхностями такого типа. Методом ПЭМ-МД исследовано влияние рН на связывание микрогелевыми пленками фермента глюкозооксидазы (ГО). Оно преимущественно определяется рН и ионной силой, поскольку изменения рН контролируют степень заряженности взаимодействующих компонентов, а низкомолекулярные ионы эффективно экранируют электростатические взаимодействия. Наилучшее включение ГО происходит в условиях, когда фермент и микрогель заряжены противоположно (при рН 7). Значительно меньшее количество ГО взаимодействует с адсорбированными частицами микрогеля при рН 9,5, в условиях, при которых практически все аминогруппы 10ДМАПМА-5БИС депротонированы. Если взаимодействие ГО с микрогелевой пленкой происходит при рН 3, то ее адсорбция не происходит вовсе, так как в данных условиях одноименно заряженные микрогель и фермент отталкиваются друг от друга. Связывание ГО микрогелем при рН 7 в присутствии 150 мМ NaCl затруднено (масса связанного фермента оказывается относительно небольшой), свидетельствуя о том, что присутствие соли ослабляет взаимодействие 10ДМАПМА-5БИС с ГО. Таким образом, данные эксперименты подтверждают доминирующую роль электростатических сил во взаимодействии ферментов с микрогелями. Показано, что при оптимальных условиях адсорбции фермента (рН 7 и 25оС) прирост удельной «влажной» массы пленки в результате связывания фермента коррелирует с массой слоя микрогеля, который был адсорбирован на предыдущей стадии, а также с количеством катионных сомономерных звеньев (ДМАПМА) в микрогеле, способных к связыванию с ферментом. Проведены эксперименты по визуализации микрогелевых и микрогель-ферментных пленок на золотой поверхности кварцевых резонаторов методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). По данным АСМ микрогелевые ленки из 10АПМА-5БИС и 3АПМА-5БИС, сканированые в сухом состоянии на воздухе, состоят из небольших полусферические объекты с относительно узким распределением по размерам. Наблюдаемые объекты представляют собой отдельные частицы микрогелей, которые деформированы вследствие сильного взаимодействия с поверхностью. Показано, что частицы микрогелей покрывают поверхность сплошным «ковром», при этом латеральный размер и высота объектов в случае 3АПМА-5БИС оказались больше, чем для 10АПМА-5БИС, что согласуется с данными динамического светорассеяния, согласно которым частицы 3АПМА-5БИС примерно в 1,5 раза крупнее, чем частицы 10АПМА-5БИС. Вид пленок не изменяется после взаимодействия микрогелей с ГО. Это указывает на то, что взаимодействие микрогелевой пленки с ферментом не вызывает какой-либо существенной ее перестройки или десорбции микрогеля. Однако более детальное сканирование микрогель-ферментных пленок 10АПМА-5БИС/ГО и 3АПМА-5БИС/ГО (размер скана 1 на 1 мкм) позволяет видеть существенные различия в их микроструктуре. Обнаружено, что помимо частиц микрогелей на поверхности становятся различимы мелкие сферические объекты, размер которых составляет примерно 10 нм. Эти объекты представляют собой отдельные глобулы ГО, и в случае 10АПМА-5БИС на микрогелевой пленке таких мелких объектов обнаруживается существенно больше, чем в случае 3АПМА-5БИС. Такая прямая визуализация подтверждает, что количество фермента, которое взаимодействует с микрогелем, определяется содержанием в нем катионных сомономерных звеньев (АПМА). Методом АСМ была изучена устойчивость микрогелевых и микрогель-ферментных пленок 3АПМА-5БИС на поверхности высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ) при воздействии температуры. Обнаружено, что 3АПМА-5БИС при адсорбции из сильнощелочных сред (рН 9,5) даже при комнатной температуре образует практически сплошную пленку, состоящую из близко расположенных друг к другу частиц микрогеля. Их высота и латеральный диаметр свидетельствуют о значительной деформации, что является следствием сильного взаимодействия с поверхностью. При понижении рН от 9,5 до 7 микрогелевая пленка заряжается (протонирование сомономерных звеньев АПМА) и приобретает способность связывать значительные количества ГО. На полученных изображениях отчетливо видны многочисленные маленькие круглые светлые объекты размером около 10 нм, находящиеся между адсорбированными частицами микрогеля. Очевидно, что они представляют собой глобулы фермента, которые, по-видимому, связаны с периферийными, выдающимися наружу фрагментами составляющих микрогель (суб)цепей. В то же время те глобулы ГО, которые находятся внутри адсорбированных частиц микрогеля, не могут быть визуализированы. Связывание фермента не приводит к существенному изменению количества адсорбированных частиц микрогеля на поверхности, свидетельствуя тем самым об отсутствии их десорбции в ходе электростатической иммобилизации фермента. Обнаружено, что микрогель-ферментная пленка, как и не содержащая фермент микрогелевая пленка, способна проявлять термочувствительность. Так, содержащие ГО сильно деформированные адсорбированные частицы микрогеля после продолжительного нагревания (1 час при 50оС и рН 7,5) становятся менее «сплющенными», существенно (примерно в 3 раза) увеличиваясь в высоте и заметно (примерно в 2 раза) уменьшаясь в латеральном диаметре. Последующее охлаждение (1 час при 25оС и рН 7,5) сопровождается практически полным восстановлением размеров и формы адсорбированных частиц микрогеля, подтверждая обратимость наблюдаемых изменений. Подобные изменения температуры не приводят к существенному изменению количества адсорбированных частиц микрогеля на поверхности, то есть их десорбции при варьировании температуры не наблюдается. В то же время охлаждение предварительно прогретой (1 час при 50оС и рН 7,5) микрогель-ферментной пленки сопровождалось некоторым уменьшением количества глобул ГО, что может быть обусловлено выделением части фермента из адсорбированных частиц микрогеля. Методом ПЭМ-МД изучена устойчивость микрогелевых и микрогель-ферментных пленок к воздействию температуры для микрогеля 10ДМАПМА-5БИС. Для этого на золотой поверхности кварцевого резонатора в оптимальных условиях формировали микрогелевую пленку или микрогель-ферментную пленку (10ДМАПМА-5БИС/ГО). Затем каждую систему подвергали температурному циклированию, при котором сначала увеличивали температуру до 50оC, вызывая коллапс микрогеля, и затем уменьшали до 25оC, восстанавливая набухание микрогеля. Совпадение значений «влажной» массы и модулей сдвига в начале и конце термоциклов подтверждает то, что как микрогелевая так и микрогель-ферментная пленки сохраняют стимулчувствительность и практически не теряют свою массу при термоциклировании. Исследовано формирование микрогель-ферментных пленок с помощью двух различных способов. Способ А заключается в проведении последовательной двухстадийной адсорбции микрогеля и фермента. На первой стадии происходит адсорбция микрогеля в оптимальных условиях (высокие рН и повышенная температура). Далее происходит связывание фермента в «мягких» условиях при постоянной температуре 25оС и при pH, при котором микрогель и фермент противоположно заряжены (рН 7). После каждой стадии проводились промывка и высушивание. Способ Б представляет собой адсорбцию комплексов «микрогель-фермент», которые были предварительно сформированы в водном растворе со значением pH, при котором микрогель и фермент заряжены противоположно (рН 7), то есть способны к электростатическому взаимодействию друг с другом. После адсорбции микрогель-ферментного комплекса комплекса на поверхность проводилась промывка и высушивание. Об образовании микрогель-ферментных комплексов свидетельствует обнаруженное методом лазерного микроэлектрофореза уменьшение дзета-потенциала частиц микрогеля при увеличении содержания фермента в его растворе. Однако, при соотношении компонентов больше 1/40 по данным динамического светорассеяния наблюдается агрегация комплексных частиц, что делает сложным воспроизводимое формирование микрогель-ферментных пленок и интерпретацию данных. Было исследовано комплексообразование 10ДМАПМА-5БИС и ГО в водных средах с последующей модификацией микрогель-ферментными комплексами проводящих поверхностей (золото, графит). В частности, микрогель-ферментный комплекс получали простым смешением водных растворов 10ДМАПМА-5БИС и ГО в условиях, когда они противоположно заряжены (рН 7). Методом ПЭМ-МД установлено, что такие комплексы более эффективно (в отличие от исходного микрогеля в тех же условиях) адсорбируются на золотой поверхности кварцевого резонатора, образуя прочно удерживающиеся на них пленки, которые не смываются при последующем промывании их растворителем. Кроме того, было показано, что содержание фермента в микрогеле также влияет и на свойства, в частности вязкоупругие свойства, образующихся микрогель-ферментных пленок. Так, более жесткие пленки, характеризующиеся низкой диссипацией и высокими значениями модуля сдвига, формируются при адсорбции микрогель-ферментных комплексов с большими содержаниями фермента. Методом АСМ было показано, что эффективность модификации поверхности (количество комплексных частиц на единицу поверхности) закономерно возрастает с увеличением содержания фермента в составе микрогель-ферментного комплекса. Биосенсорные характеристики пленок, полученных адсорбцией микрогель-ферментных комплексов на планарных графитовых электродах (ПГЭ), были определены методом амперометрии. В частности, микрогель-ферментные пленки, на основе 10ДМАПМА-5БИС и ГО, продемонстрировали хорошую чувствительность по отношению к глюкозе (0,00746 A × M-1 × см−2), низкий предел обнаружения (1 мкM) и широкий линейный диапазон (1–2000 мкM). Обнаружено, что биосенсорные системы, полученные в результате адсорбции микрогель-ферментного комплекса, характеризуются повышенной операционной стабильностью (по-видимому, вследствие локализации фермента во внутренней области частиц микрогеля). Так, при многократных измерениях уменьшение отклика биосенсора на одно измерение составляет 0,30 ± 0,11%, что существенно меньше значения 2,14 ± 0,18%, определяемого для аналогичного биосенсора, сформированного двухстадийной последовательной адсорбцией. Наконец, биосенсорные системы, полученные в результате адсорбции микрогель-ферментного комплекса, более устойчивы к потере (выделению из них) фермента при изменении условий окружающей среды, таких как рН и/или ионная сила. Например, 10-ти минутная обработка такой системы щелочным (рН 9,5) раствором приводит к 20%-ному уменьшению электрохимического отклика, тогда как для аналогичного биосенсора, сформированного двухстадийной последовательной адсорбцией, такая обработка сопровождается более чем 30%-ным уменьшением. Используя аналогичные подходы, были получены комплексы микрогеля 10АПМА-5БИС с ферментом холиноксидазой (ХО), состав которых варьировали от [ХО]:[АПМА] = 1:200 до 1:20. Такие системы также характеризовались лучшей операционной стабильностью за счет локализации фермента во внутренней области частиц микрогеля. При многократных измерениях уменьшение отклика биосенсора на одно измерение составляет 0,22 ± 0,10%, что значительно меньше значения 4,54 ± 0,17%, определяемого для аналогичного биосенсора, сформированного двухстадийной последовательной адсорбцией. Также были получены комплексы 10ДМАПМА-5БИС с ферментом бутирилхолинэстеразой (БХЭ) состава [БХЭ]:[ДМАПМА] = 1:50 и предпринята попытка формирования биферментной биосенсорной системы из смеси двух комплексов ХО/10АПМА-5БИС и БХЭ/10ДМАПМА-5БИС, оба состава 1:50. Используя субстрат бутирилхолин, регистрировали отклик каскадного процесса, в котором сначала БХЭ продуцировала масляную кислоту и холин, а далее холин подвергался окислению ХО. Однако сколько-нибудь заметного отклика зарегистрировать не удалось, поэтому продолжение таких экспериментов сочли нецелесообразным. Выявление основных закономерностей взаимодействия рН- и термочувствительных микрогелей с твердыми поверхностями и условий последующего связывания ими ферментовпозволило перейти к формированию микрогель-ферментных пленок на поверхности ПГЭ. Такие конструкции позволяют использовать методы электрохимии для исследования ферментативной активности ферментов в составе микрогель-ферментных пленок. Микрогель-ферментные пленки наносили на поверхность ПГЭ, модифицированных наночастицами MnO2 (для придания электродам пероксидчувствительных свойств). Поскольку поверхность ПГЭ значительно более разветвленная, чем золотая поверхность кварцевого резонатора, то для получения лучших характеристик биосенсорных конструкций была проведена дополнительная оптимизация на стадиях нанесения микрогелей и ферментов. В частности, была оптимизирована концентрация растворов микрогелей и концентрации растворов ферментов, из которых производится адсорбция, а также подобрано время адсорбции на каждой стадии. В результате оптимизации установлены оптимальные концентрации растворов микрогелей для нанесения 5 г/л, оптимальные концентрации растворов ферментов 5*10-5 М, время адсорбции микрогелей 60 мин, время нанесения ферментов 40 мин. Выявленные оптимальные условия использовали для формирования биосенсорных поверхностей в последующих экспериментах. Проведено сравнение электрохимических откликов по глюкозе для биосенсорных конструкций ПГЭ-MnO2/микрогель/ГО для микрогелей 10АПМА-5БИС, 5АПМА-5БИС, 3АПМА-5БИС, 1АПМА-5БИС, а также для контрольной системы, не содержащей микрогели. Обнаружено, что чувствительность биосенсорной конструкции (наклон калибровочной зависимости) определяется количеством фермента, которое способен связывать микрогель: чем выше содержание АПМА-сомономера, тем больше ГО можно иммобилизовать на сенсорной поверхности, соответственно, тем лучше чувствительность. Отметим, крайне низкую чувствительность биосенсорных конструкций, которая мало отличается от контроля (без микрогеля) если содержание АПМА-сомономера в микрогеле составляет 1 мольн. %. Дальнейшая работа с образцами микрогелей, содержание АПМА в которых составляет 1 мольн. %., не представляется целесообразной. Наилучшими аналитическими характеристиками обладала биосенсорная конструкция ПГЭ-MnO2/10АПМА-5БИС/ГО. В частности, она демонстрировала высокую чувствительность по отношению к глюкозе (0,162 A × M−1 × см−2), низкий предел обнаружения (0,4 мкM) и достаточно широкий линейный диапазон (0,4–400 мкM). Проведено тестирование биосенсорных конструкций в режиме многократного измерения сигнала в ответ на добавление фиксированного количества глюкозы на одном и том же электроде в стандартных условиях. Обнаружено, что биосенсорные системы на основе 10АПМА-5БИС и 3АПМА-5БИС хотя и теряли 10-15 % откликов на начальном этапе измерений, однако демонстрировали хорошую операционную стабильность, начиная с 3-4 последовательного измерения. Обработка глутаровым альдегидом позволяла за счет ковалентной пришивки фермента к АПМА-группам микрогеля дополнительно стабилизировать систему и избежать первичной потери активности. При обработке глутаровым альдегидом системы ПГЭ-MnO2/10АПМА-5БИС/ХО за счет ковалентной пришивки фермента удалось существенно повысить операционную стабильность биосенсорной конструкции. Исследовано влияние соли (инкубация в растворе NaCl) на электрохимические отклики биосенсорных конструкций. Обнаружено, что 15-мин обработка в соли (0,5 М и более) вызывает уменьшение наблюдаемых откликов в системах ПГЭ-MnO2/10АПМА-5БИС/ГО и ПГЭ-MnO2/3АПМА-5БИС/ГО на 35-40%. Это происходит за счет экранирования электростатические взаимодействия между ферментом и АПМА-группами мирогелей и выделения в результате некоторого количества ГО из микрогелей. Отметим, что выделение не полное, что может быть обусловлено прочным удерживанием ГО внутри частиц микрогелей, возможно не только за счет электростатического связывания, но также за счет гидрофобных взаимодействий и стерического фактора. Аналогичное поведение при воздействии солью наблюдалось для системы ПГЭ-MnO2/10АПМА-5БИС/ХО. Таким образом, воздействие солью позволяет селективно удалить ферменты из внешних областей частиц микрогелей и, таким образом, получить системы с локализацией ферментов преимущественно во внутренних областях микрогелей. Исследовано влияние температурного коллапса микрогелей 10АПМА-5БИС, 5АПМА-5БИС и 3АПМА-5БИС на ферментативную активность иммобилизованной ГО для демонстрации принципиальной возможности создания биосенсоров с регулируемым откликом. Зависимости сенсорных откликов, измеренные при различных температурах, свидетельствуют о том, что в низкотемпературной области наблюдается их закономерное увеличение, поскольку увеличение температуры способствует ускорению ферментативной реакции. Построение данных в координатах Аррениуса позволяет видеть, что низкотемпературные ветви спрямляются в данных координатах. Однако, начиная с некоторой температуры, зависимости прекращают рост, и наблюдается понижение наблюдаемых ферментативных активностей, а в координатах Аррениуса на зависимостях появляются характерные изломы. Температуры, при которых происходит данное явление, близки к температурам фазового перехода в соответствующих микрогелевых матрицах. Кроме того, анализ зависимостей, полученных при различных рН, указывает на то, что температуры изломов сдвигаются в область более низких значений, а наклоны Аррениусовских зависимостей для высокотемпературных ветвей увеличиваются. Это позволяет сделать вывод о том, что влияние коллапса микрогелевой матрицы усиливается при переходе к щелочным рН. Полученные данные отлично коррелируют с рН-зависимым температурным поведением чистых микрогелей при различных рН, которые свидетельствуют о том, что коллапс микрогелей усиливается по мере их депротонирования. Следует отметить, что подобное поведение совершенно нехарактерно для нативной ГО. Для этого влияние температуры на активность нативной ГО была исследована независимым спектрофотометрическим методом. Показано, что она возрастает во всем исследованном температурном интервале, а Аррениусовская зависимость сохраняет линейность, при этом никаких отклонений от прямолинейности не наблюдается. Это служит независимым подтверждением того, что наблюдаемое «аномальное» температурное поведение ГО, иммобилизованной в термочувствительные микрогели, является следствием фазового перехода последних при повышении температуры. Определив температуры изломов (Т излома) из Аррениусовских зависимостей, далее проводили измерения сенсорных откликов в циклическом режиме изменения температуры 25оС – Т излома - 50оС - Т излома - 25оС, чтобы продемонстрировать многократную регуляцию сенсорных откликов и оценить ее обратимость при различных рН. Полученные данные подтвердили, что в пределах каждого цикла (за исключением 1-го цикла) сенсорный отклик при 50оС близок по значению к сенсорному отклику при Т излома. Это может означать, что при Т > Т излома ферментативная реакция подавляется вследствие вызываемого повышением температуры коллапса микрогелевой матрицы. Важным является то, что данный эффект воспроизводится от цикла к циклу (начиная со 2-го цикла). Полученные данные подтверждают возможность многократной регуляции ферментативной активности за счет коллапса микрогелевой матрицы. Нельзя не отметить постепенное снижение общего уровня сенсорных откликов. Можно предположить несколько причин, по которым это может происходить: например, медленная термоинактивация иммобилизованной ГО и/или ее выделение из микрогелевого покрытия (возможность этого была продемонстрирована методом АСМ). Для того, чтобы оценить влияние термоинактивации ГО была проведена дополнительная серия экспериментов с нативным ферментом. Для этого спектрофотометрическим методом было исследовано изменение наблюдаемой активности нативной ГО при длительной инкубации при высокой температуре (50оС). Эксперименты проводили при трех значениях рН (7,5, 8,5 и 9). Следует подчеркнуть, что для данной серии экспериментов с нативной ГО были выбраны достаточно жесткие условия (высокая температура и длительная 2-х часовая инкубация), которые, как правило, никогда не достигались в экспериментах с иммобилизованным ферментом. И даже в таких условиях нативная ГО демонстрирует относительно небольшое уменьшение наблюдаемой активности при рН 7,5, хотя, конечно, при других значениях рН ее инактивация была выражена существенно сильнее. По результатам данных экспериментов можно заключить, что медленная термоинактивация иммобилизованного фермента возможна, и это, в принципе, может давать некоторый вклад в общее снижение уровней ферментативной активности при длительных циклических температурных экспериментах. Биосенсорные конструкции, полученные в результате адсорбции предварительно сформированного в растворе микрогель-ферментного комплекса (Способ Б), также демонстрировали возможность обратимого изменения наблюдаемой активности ГО, иммобилизованной в 10ДМАПМА-5БИС, за счет температурного коллапса микрогеля при нагревании. Зависимость сенсорных откликов такой системы от температуры, построенная в прямых координатах и в координатах Аррениуса, демонстрировала характерные отклонения от линейности при температурах, превышающих 32оС. В целом температурное поведение активности иммобилизованной глюкозооксидазы схоже с температурным поведением системам, формируемых способом последовательного нанесения, однако можно отметить более сильное уменьшение наблюдаемой активности фермента при температуре выше 32оС. При температурах, превышающих 40оС, наблюдаемая активность становится даже ниже, чем активность при 20 оС. Характерно, что температура излома составляет 32оС, что соответствует температуре фазового перехода в случае чистого ПНИПАМ. По-видимому, фермент при формировании комплексов с микрогелем в растворе, эффективно взаимодействует со всеми звеньями ДМАПМА, подавляя их влияние на термочувствительность микрогеля. Исследование влияния циклического изменения температуры показало, что такая многократная регуляция ферментативной активности возможна также и для систем, сформированных Способом Б, хотя для них и наблюдается постепенное снижение общего уровня наблюдаемой активности. Методом последовательной адсорбции получены биферментные биосенсорные конструкции на основе ХО и БХЭ, в которых оба фермента локализованы внутри одной частицы микрогеля. За счет разницы в размерах белковых глобул (ХО – маленький димер, БХЭ – крупный тетрамер) при взаимодействии с сетчатыми структурами (микрогели) могут возникать системы, обогащенные изнутри ХО, а по поверхности – БХЭ. При этом использование различных последовательностей нанесения каждого из двух ферментов (сначала ХО затем БХЭ; сначала БХЭ затем ХО; или нанесение из смеси двух ферментов), а также варьирование их концентраций (низкие или высокие) позволяет конструировать системы, в которых закономерно меняется соотношение количеств каждого их ферментов и их распределение внутри частиц микрогеля. Кроме того, обнаружено, что природа микрогеля оказывает влияние на количества и распределение каждого их двух ферментов в его частицах. Исследовано влияние температурного коллапса 10АПМА-5БИС и 10 ДМАПМА-5БИС на электрохимические отклики иммобилизованных ХО и БХЭ для исследования принципиальной возможности создания биферментных биосенсоров с регулируемым откликом. Обнаружено, что в низкотемпературной области наблюдается ожидаемое возрастание ферментативной активности, поскольку увеличение температуры способствует ускорению ферментативной реакции. Однако, начиная с некоторой температуры, зависимости прекращают рост, и наблюдается понижение наблюдаемых откликов, что возможно связано с коллапсом микрогелевых матриц. В то же время измерение откликов при охлаждении систем показало, что они не возвращаются к исходному уровню. Более того, в случае ХО наблюдается практически полная потеря ферментативной активности. Поскольку данные ферменты не обладают высокой термостабильностью, то очевидно, что нагревание биферментных систем ХО-БХЭ до температур выше 40 оС (при которых наблюдается коллапс микрогелей) приводит к их сильной термоинактивации, что может осложнить интерпретацию полученных данных.