ИСТИНА

Проект направлен на исследование актуальной и малоизученной проблемы – участия и роли в регуляции нервно-мышечной синаптической передачи предшественника нейротрофина мозга (BDNF – brain-derived neurotrophic factor) - proBDNF и образующегося за счет его протеолиза продомена BDNF – побочного продукта «созревания» BDNF. BDNF, хорошо известный нейротрофин семейства полипептидных факторов роста, в последнее время достаточно широко исследуется как преимущественно ретроградный регулятор синаптической передачи в моторных синапсах, реализующий целый спектр пресинаптических эффектов (Hurtado et al., 2017; Simo et al, 2018; Gaydukov et al., 2018; Gaydukov et al., 2019). И предшественник BDNF (proBDNF), и продукт образования BDNF (продомен BDNF) потенциально способны проявлять собственное сигнальное действие. Запланированное изучение регуляторных эффектов proBDNF и продомена BDNF именно в моторных синапсах отличается исключительной новизной, поскольку, несмотря на присутствие в них потенциальной мишени их рецепторного действия - рецептора p75 (Garcia et al., 2010), данные о самостоятельном модулирующем квантовую секрецию медиатора действии proBDNF и продомена BDNF в моторных синапсах (в отличие от синапсов ЦНС), практически отсутствуют. В ходе выполнения проекта будут изучены проявления регуляторного влияния (судя по пилотным экспериментам – преимущественно негативные) proBDNF и продомена BDNF на спонтанную и вызванную стимуляцией нерва быструю синхронную квантовую секрецию ацетилхолина как в зрелых моторных синапсах мыши (m. diaphragm и m.extensor digitorum longus (EDL)), так и в синапсах, новообразуемых после пережатия нерва, которые функционально отличаются от зрелых (m. EDL). Конкретными целями проекта являются выявление рецепторов, через активацию которых реализуется регуляторное действие proBDNF и продомена BDNF в зрелых и новообразованных в ходе реиннервации моторных синапсов, а также запускаемых при активации этих рецепторов сигнальных каскадов и финальных мишеней этих каскадов, обеспечивающих изменения нервно-мышечной передачи. Поиск финальных мишеней proBDNF и продомена BDNF будет проводиться среди спектра пресинаптических калиевых каналов (GIRK, потенциал-зависимые Kv-каналы, кальций-активируемые SK-каналы и BK-каналы), способных опосредованно контролировать уровень активности триггерных потенциал-зависимых кальциевых каналов моторных терминалей и уровень секреции медиатора. Исследования будут проводиться с использованием классического электрофизиологического метода регистрации постсинаптических потенциалов (или, если потребуется, постсинаптических токов в режиме двухэлектродной фиксации потенциала мышечных волокон) в сочетании с селективными фармакологическими воздействиями на интересующие компоненты сигнальных каскадов и их финальных мишеней. Параллельно будут использованы молекулярно-биологические методики (иммуноферментный анализ и вестерн-блоттинг) для подтверждения наличия в моторных синапсах proBDNF, компонентов запускаемых proBDNF и продоменом BDNF сигнальных путей и их мишеней. В ходе выполнения проекта предполагается охарактеризовать механизмы регуляции квантовой секреции медиатора (ацетилхолина) в моторных синапсах под действием proBDNF и продомена BDNF. Актуальность решения данной проблемы обусловлена необходимостью более детального исследования и переоценки однозначного действия BDNF в моторных синапсах с учетом реального спектра возможных одновременно сосуществующих влияний не только зрелого BDNF, но и proBDNF и/или продомена BDNF на параметры синаптической передачи.

The project is aimed at investigating a highly topical and little-studied problem - the participation and role in the regulation of neuromuscular synaptic transmission of the precursor of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) - proBDNF and the prodomain BDNF, a by-product of BDNF maturation, formed due to proBDNF proteolysis. BDNF, a well-known neurotrophin of the family of polypeptide growth factors, has recently been widely studied as a predominantly retrograde regulator of synaptic transmission in motor synapses, realizing a whole spectrum of presynaptic effects (Hurtado et al., 2017; Simo et al., 2018; Gaydukov et al., 2018; Gaydukov et al., 2019). Both the BDNF precursor (proBDNF) and the BDNF maturation product (BDNF prodomain) are potentially capable of exerting their own signaling effects. The planned study of the regulatory effects of proBDNF and the BDNF prodomain precisely in motor synapses is extremely novel, because, despite the presence of a potential target of their receptor action, the p75 receptor (Garcia et al., 2010), data concerning modulation of quantal neurotransmitter release by proBDNF and BDNF prodomain in motor synapses (in contrast to CNS synapses) are practically absent. In the course of the project, the manifestations of the regulatory influence (judging by the pilot experiments, mostly negative) of proBDNF and the BDNF prodomain on the spontaneous and induced by nerve stimulation, rapid synchronous quantal release of acetylcholine will be researched, both in mature motor synapses of mice (m. diaphragma and m. extensor digitorum longus (m. EDL)) and in newly-formed synapses after nerve clamping, which are functionally different from mature ones (m. EDL). The specific goals of the project are to identify receptors via the activation of which the regulatory action of proBDNF and the BDNF prodomain is realized in mature and newly-formed motor synapses during reinnervation, as well as signaling cascades triggered by activation of these receptors and the final targets of these cascades that provide changes in neuromuscular transmission. The search for the final targets of proBDNF and the BDNF prodomain will be carried out among the spectrum of presynaptic potassium channels (GIRK, calcium-activated SK-channels and BK channels), which can indirectly control the level of activity of voltage-gated calcium channels of motor terminals and the level of transmitter release. The studies will be carried out using the classical electrophysiological method of recording postsynaptic potentials (or, if required, postsynaptic currents in the mode of two-electrode voltage-clamp) in combination with selective pharmacological effects on the components of signaling cascades of interest and their final targets. In parallel, molecular biological techniques (enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting) will be used to confirm the presence in motor synapses of components triggered by proBDNF and the BDNF prodomain of signaling pathways and their targets. In the course of the project, it is planned to characterize the mechanisms of regulation of the quantal release of a neurotransmitter (acetylcholine) in motor synapses by proBDNF and the BDNF prodomain. The urgency of solving this problem is due to the need for a more detailed study and reevaluation of the unambiguous action of BDNF in motor synapses, taking into account the real spectrum of possible simultaneously coexisting influences of not only mature BDNF, but also proBDNF and / or BDNF prodomain on the parameters of synaptic transmission.

Запланирован ряд взаимосвязанных серий экспериментов, направленных на раскрытие молекулярных механизмов синаптического действия proBDNF и продомена BDNF в моторных синапсах m. diaphragmа и m. EDL (интактных и новообразованных после пережатия нерва) мыши. Основной метод – микроэлектродная электрофизиологическая регистрация и анализ параметров спонтанных МПКП и вызванных ПКП (в ходе генерации ритмических залпов ПКП (50 Гц, 1 с). Выявленные в ходе выполнения проекта изменения параметров МПКП и ПКП результате действия продомена BDNF, расщепляемой и устойчивой к расщеплению форм proBDNF будут далее подвергнуты проверке (с использованием селективных блокаторов) на возможное участие в реализации этих изменений калиевых каналов: входящего выпрямления - GIRK, кальций-активируемых малой проводимости – SK; кальций-активируемых большой проводимости – BK. В случае выявления неучастия в реализации эффектов продомена BDNF и proBDNF всех вышеперечисленных калиевых каналов предусмотрена дополнительная серия экспериментов, которая будет направлена на выявление возможного вклада потенциалзависимых калиевых каналов в реализацию синаптического модулирующего влияния proBDNF и продомена BDNF. Далее планируется выявить участие в реализации синаптических эффектов proBDNF и продомена BDNF в интактных и новообразованных моторных синапсах мыши p75-рецепторов (с использованием блокатора их сигналинга TAT-Pep5) и сигнального каскада с участием RhoA (с использованием ингибитора Y27632). Запланирован сравнительный анализ с использованием гель-электрофореза и Вестерн-блоттинга уровня p75 в образцах используемых в проекте нервно-мышечных препаратов, а также анализ уровня активации RhoA при действии на нервно-мышечные препараты продомена BDNF и proBDNF путем комбинированного иммуноферментного анализа общего уровня RhoA и уровня активного RhoA, ассоциированного с GTP. В ТЕЧЕНИЕ ПЕРВОГО ГОДА РАБОТЫ (2022-2023 гг.) планируется провести основную часть исследований в рамках решения задач 1 и 2, упомянутых в пункте 4.3, а именно: 1. Финализировать исследования изменений параметров спонтанной и вызванной синаптической активности в зрелых и новообразованных моторных синапсах под действием proBDNF (расщепляемой и нерасщепляемой форм) и продомена BDNF при их экзогенной действии (каждый – в концентрации 1 нМ) на нервно-мышечные препараты (задача 1). 2. Исследовать влияние на спонтанную и вызванную синаптическую передачу в зрелых и новообразованных моторных синапсах совместного введения продомена BDNF и зрелого BDNF (в эквимолярной концентрации 1 нМ) (задача 1). 3. Провести масштабные электрофизиологические исследования по установлению, какие именно калиевые каналы – GIRK, SK или BK – участвуют в реализации синаптических эффектов proBDNF и продомена BDNF в зрелых и новообразованных синапсах мыши. Данные серии экспериментов будут проведены с использованием экзогенной аппликации proBDNF или продомена BDNF в присутсвии селективных ингибиторов калиевых каналов – тертиапина (GIRK), апамина (SK), ибериотоксина или паксиллина (BK) (задача 2). В результате проведенных исследований 1-го года работы: 1. Будут окончательно финализированы (с учетом имеющихся предварительных результатов) приоритетные данные о в целом негативном характере модулирования различных параметров спонтанной и вызванной синаптической передачи под действием расщепляемого proBDNF, устойчивого к расщеплению proBDNF и продомена BDNF в зрелых и новообразованных после пережатия моторных синапсах. 2. Будут получены данные о сравнительной силе регуляторного влияния на синаптическую передачу в зрелых и новообразованных синапсах продомена BDNF и зрелого BDNF. Учитывая наши предварительные данные об отсутствии влияния 1 нМ расщепляемого proBDNF (служащего источником продомена и зрелого BDNF) на синаптическую передачу в зрелых моторных синапсах и снижения частоты МПКП в новообразованных синапсах, где в результате травмы может быть повышен уровень p75, мы ожидаем выявления более высокого вклада продомена BDNF в регуляцию секреции ацетилхолина в новообразованных синапсах по сравнению со зрелыми 3. Будут получены данные, какой (или какие) именно калиевые каналы (GIRK, SK или BK) моторных нервных терминалей обеспечивают угнетающее действие продомена BDNF и (возможно) proBDNF на квантовую секрецию в зрелых и новообразованных моторных синапсах. В ТЕЧЕНИЕ ВТОРОГО ГОДА РАБОТЫ (2023-2024 гг.) планируется на основе результатов решения задач 1 и 2, упомянутых в пункте 4.3, выполнить задачу 3, а именно: 1. Электрофизиологически исследовать роль p75 рецепторов как потенциальной мишени proBDNF и продомена BDNF в моторных синапсах, через активацию которых эти сигнальные молекулы могут реализовывать свои синаптические эффекты. В качестве фармакологического инструмента будет использован блокатор сигналинга p75 – TAT-Pep5 в сочетании с аппликацией proBDNF (его расщепляемой или нерасщепляемой формы – выбор будет сделан по результатам решения задачи 1 в ходе 1го года выполнения проекта) или продомена BDNF. 2. Сопоставить уровень белка p75 в образцах иннервированной и неиннервированной частей мышечных волокон m. diaphragma, m. EDL (интактная) и m. EDL (реиннервированная после пережатия нерва, с новообразованными синапсами). с использованием гель-электрофореза и Вестерн-блоттинга. 3. Провести электрофизиологическую оценку роли RhoA-сигнального пути в качестве вероятного посредника в реализации синаптических эффектов proBDNF и продомена BDNF в моторных синапсах. В качестве фармакологического инструмента будет использован ингибитор RhoA - Y27632 в сочетании с аппликацией proBDNF (его расщепляемой или нерасщепляемой формы – выбор будет сделан по результатам решения задачи 1 в ходе 1го года выполнения проекта) или продомена BDNF. 4. Оценить увеличение активности RhoA с использованием в образцах иннервированной и неиннервированной частей мышечных волокон m. diaphragma, m. EDL (интактная) и m. EDL (реиннервированная после пережатия нерва, с новообразованными синапсами) в результате действия proBDNF (его расщепляемой или нерасщепляемой формы – выбор будет сделан по результатам решения задачи 1 в ходе 1го года выполнения проекта) или продомена BDNF.

Мы провели пилотные эксперименты на зрелых и новообразованных синапсах, исследуя влияния расщепляемой формы proBDNF и продомена BDNF (оба – 1 нМ) на параметры спонтанной и вызванной секреции (при короткой высокочастотной стимуляции нерва) ацетилхолина. ProBDNF вызвал статистически значимое снижение частоты МПКП в новообразованных, но не зрелых синапсах, в которых расщепляемый предшественник нейротрофина был неэффективен в плане изменения каких либо параметров как спонтанной, так и вызванной секреции ацетилхолина. По результатам пилотных экспериментов в зрелых синапсах продомен BDNF оказывает мощное угнетающее действие как на спонтанную секрецию квантов ацетилхолина (уменьшение как частоты МПКП, так и их амплитуды), так и на вызванный многоквантовый синхронный выброс медиатора (уменьшение амплитуды и квантового состава ПКП в залпах). При этом в новообразованных синапсах уменьшение амплитуд ПКП сопровождается постоянством квантового состава за счет роста амплитуды МПКП. Эти предварительные данные позволяют предполагать увеличение под действием продомена пресинаптической калиевой проводимости, снижающей поступление ионов кальция в терминаль, что негативно сказывается на уровне нервно-мышечной передачи. Эти результаты требуют проверки, и механизмы в целом негативного влияния продомена BDNF (и proBDNF) планируется более подробно рассмотреть в данном проекте с детальным анализом того, за счет чего угнетается квантовая секреция ацетилхолина.

Мы впервые показали ранее неизвестную активность двух пептидных побочных продуктов процессинга BDNF (proBDNF и продомен BDNF) в моторных синапсах мышей. Эти сигнальные молекулы участвуют в регуляции выброса квантов АХ, и их эффекты в большинстве случаев отличаются от эффектов зрелого BDNF. ЗРЕЛЫЕ МОТОРНЫЕ СИНАПСЫ ДИАФРАГМЫ МЫШИ. Расщепляемый proBDNF (1 нМ) в зрелых моторных синапсах не влияет на параметры спонтанного и вызванного выброса АХ. Отсутствие влияний на секрецию медиатора у proBDNF, в отличие от его тормозного действия, наблюдавшегося в новообразованных синапсов, очевидно, связано с возможными изменениями функционирования пронейротрофинов в зрелых моторных синапсах. Нами был обнаружен неизвестный ранее широкий спектр выраженных тормозных влияний продомена BDNF на спонтанную (одноквантовую) и вызванную синхронную многоквантовую секрецию ацетилхолина в зрелых моторных синапсах: снижение частоты МПКП, уменьшение квантового состава ПКП в коротком высокочастотном залпе и снижение амплитуды постсинаптических потенциалов (возникающее не за счет снижения входного сопротивления мышечных волокон). Сортилин играет ключевую роль неотъемлемого компонента рецепторного комплекса с рецептором p75 (но не с TrkB), обеспечивающего совместно «правильную» рецепцию продомена BDNF и запуск сигнального пути с участием RhoА и Rho-киназы, направленного на активацию калиевых каналов GIRK и SK. Открытие участия каналов GIRK в негативной регуляции квантовой секреции в моторных синапсах млекопитающих двумя ранее неизученными сигнальными молекулами, связанными с BDNF, является еще одним приоритетом коллектива. Известно, что GIRK обладают своеобразным механизмом активации – со стороны Giβγ-субъединиц (при активности метаботропных рецепторов, сцепленных с Gi-белком) и фосфоинозитол-(4,5)-бисфосфата (PIP2). Мы определили конкретный тип метаботропных G-белок-сцепленных рецепторов, обеспечивающих возможность активации GIRK. Из трех пресинаптических (M2, P2Y13 и A1) исключительно А1-рецепторы аденозина оказались функционально сопряжены не только с торможением кальциевых -каналов L-типа, но и с GIRK-опосредованным угнетением квантовой секреции ацетилхолина под действием продомена BDNF. Результаты наших предыдущих исследований и данные, полученные в ходе выполнения проекта – свидетельствуют о дуальной регуляторной роли А1-рецепторов в зрелых моторных синапсах. Эти метаботропные рецепторы выступают как негативный регулятор активности L-типа Са2+-каналов, и одновременно могут играть роль коактиватора GIRK, что необходимо для реализации тормозных эффектов продомена BDNF. Используя нокаутных по гену паннексина 1 мышей или фармакологическое блокирование этого белка, мы выявили необходимость функционирование в моторных синапсах именно «паннексинового источника» синаптических пуринов (АТФ/аденозина) для А1-зависимого GIRK-опосредованного тормозного синаптического действия продомена BDNF. Мы впервые показали, что ингибирование PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10), способное сдвигать фосфолипидный метаболизм в сторону снижения содержания PIP2 полностью предотвращает торможение квантовой секреции, вызываемое продоменом BDNF в зрелых моторных синапсах диафрагмы мыши. Таким образом, мы получили доказательства того, что вовлечение GIRK в регуляцию квантовой секреции АХ в зрелых моторных синапсах мыши возникает при пространственно-временном «совпадении» эндогенной активации аденозиновых А1-рецепторов и возрастания PIP2 за счет активации PTEN в результате запуска продоменом BDNF сигнального каскада с участием Rho-киназы. Мы показали, что при запуске продоменом сигнального пути с участием Rho-киназы активация SK-каналов обеспечивается за счет функционирования рианодин-чувствительных кальциевых депо. Блокирование рианодиновых рецепторов полностью «восстанавливало» индуцируемое продоменом BDNF снижение частоты МПКП и квантового состава ПКП (оба эти параметра секреции АХ имеют пресинаптическую природу) при заблокированных SK-каналах. Вовлечение SK-каналов в реализацию негативного влияния продомена BDNF на квантовую секрецию АХ обеспечивается возможным ROCK-опосредованным торможением активности кальциевой АТФазы кальциевых депо. Такое индуцированное продоменом действие ROCK способно увеличивать внутриклеточную концентрацию ионов кальция за счет его выхода из депо через рианодиновые рецепторы и активировать SK-каналы, вовлекая их в регуляцию квантовой секреции ацетилхолина. НОВООБРАЗОВАННЫЕ МОТОРНЫЕ СИНАПСЫ. Расщепляемый proBDNF (1 нМ) снижал частоту МПКП и увеличивал значение МП мышечных волокон в новообразованных синапсах из-за активации пресинаптических калиевых каналов GIRK, но не затрагивал характеристики вызванной квантовой секреции АХ. Ингибирующий эффект proBDNF на спонтанную секрецию АХ отличается от потенцирующего действия зрелого BDNF на амплитуду постсинаптических потенциалов в регенерирующих моторных синапсах. Мы впервые показали, что в новообразованных синапсах ингибирующее действие proBDNF на частоту МПКП реализуется не за счет p75-опосредованного сигнального пути, связанного с Rho-GDI, но требует участия TrkB и сортилина. Кроме того, мы получили новые приоритетные данные, что в новообразованных синапсах вовлечение GIRK в регуляцию спонтанной секреции не сопряжено с активностью M2-, P2Y13- и A1-рецепторов. Наряду с proBDNF нами впервые исследована активность продомена BDNF в новообразованных синапсах, оказывающего там разнонаправленное действие на выброс квантов АХ: продомен действует синергично с BDNF и стимулирует увеличение размера квантов АХ, но снижает квантовый состав ПКП, то есть, как и расщепляемый пронейротрофин, стабилизирует вызванную секрецию АХ. Анализ компонентов рецепции proBDNF и продоменом BDNF показал, что запуск ими сигнальных путей в новообразованных синапсах, вызывающих целый спектр синаптических эффектов, требует участия TrkB, сортилина и p75. Cортилин в этих синапсах, по-видимому, способен взаимодействовать не только с TrkB рецепторами, но и с p75 рецепторами, обеспечивая развитие собственных синаптических эффектов у proBDNF и продомена. В случае пронейротрофина такой многокомпонентный рецепторный комплекс (сортилин/TrkB/p75) обеспечивает стабилизацию вызванной секреции АХ и снижению частоты спонтанной секреции квантов АХ (за счет активации GIRK) в функционально ослабленных моторных синапсах при реиннервации мышечных волокон. Все три компонента рецепторного комплекса необходимы для запуска сигнальных путей, обеспечивающих разнонаправленные влияния на параметры квантовой секреции АХ продомена BDNF – при ингибировании любого из этих компонентов продомен BDNF полностью утрачивал способность вызывать увеличение размера квантов АХ и снижать квантовый состав ПКП в новообразованных синапсах. GIRK-независимое снижение квантового состава ПКП в присутствии продомена BDNF соответствует современным данным об ингибирующих эффектах proBDNF (и продомена BDNF) на секрецию нейромедиаторов и развитие форм синаптической пластичности, подавляющих ее в синапсах ЦНС и регенерирующих нервно-мышечных соединениях. Анализ вовлечения сигнального каскада с участием митоген-активируемой киназы MEK1/2 в TrkB-опосредованное увеличении размера квантов АХ в новообразованных синапсах показал, что как зрелый нейротрофин, так и его продомен в равной степени задействуют этот сигнальный каскад, аналогично тому, как это происходит в зрелых моторных синапсах под действием BDNF (но не продомена BDNF). Вероятнее всего, такая синергичность действия нейротрофина мозга и его продомена обеспечивается их взаимодействием с TrkB-рецепторами (в составе рецепторного комплекса с p75 и сортилином), способными при их активации запускать сигнальный каскад с участием митоген-активируемых протеинкиназ. Новым и неожиданным фактом является выявленная нами связь MEK1/2-Erk-сигнального каскада не только с увеличением размера квантов под действием продомена BDNF в новообразованных моторных синапсах, но и с уменьшением в них квантового состава ПКП.