ИСТИНА

Расширение сферы управления почвенными процессами на основе внедрения биотехнологических приемов по иммобилизации ионов металлов в результате сорбции грибными меланинами (природными биосорбентами).

The relevance of the research results is due to the possibility of expanding the sphere of soil processes management based on the introduction of biotechnological methods for the immobilization of metal ions as a result of sorption by fungal melanins (natural biosorbents). Fungal melanin research is devoted to a wide range of biotechnological applications in various fields of biomedicine, dermatocosmetics, materials science and nanotechnology. The protective properties of fungal mycelium, including dark-colored ones, have been demonstrated in in vitro experiments with aqueous solutions of metal salts during the cultivation of fungi in a liquid medium. Practically nothing is known about the detoxification of soils containing cations of toxic metals using fungal mycelium. At the same time, the use of carbon-containing sorbents, such as biochar or humates, gives an ambiguous efficiency of remediation measures in soils of different humus status. Laboratory experiments will be carried out to study the distribution of melanized fungi in soils of different humus content under polymetallic pollution, pure cultures of dominant species will be isolated for analysis of their sorption activity with respect to copper, zinc and lead cations in liquid and soil media by classical mycological methods, the effect of organic carbon content will be studied. on the activity of sorption processes depending on the chemical composition of the media. The novelty of the project is - in the study of the effect of organic carbon on the distribution of melanized fungi during chemical contamination of soils and verification of the versatility of the bioindication indicator - the proportion of dark-colored forms in different soil conditions - in the analysis of the sorption capacity of pure cultures of melanized species of fungi in relation to metal cations in order to develop methods for their immobilization and restoration of the ecological functions of soils. - in substantiation of the proposal of a new method of soil detoxification using biosorbents of heavy metals based on the biomass of melanized fungi

Сведения о влиянии органического углерода на распределение меланизированных грибов при химическом загрязнении почв и проверке универсальности биоиндикационного показателя - доли темноокрашенных форм в разных почвенных условиях Анализ сорбционной способности чистых культур меланизированных видов грибов по отношению к катионам металлов с целью разработки способов их иммобилизации и восстановления экологических функций почв . Обоснование предложения нового способа детоксикации почв с применением биосорбентов тяжелых металлов на основе биомассы меланизированных грибов

На протяжении многих лет проводятся исследования структурных и функциональных характеристик почвенной микробиоты и динамики микологических параметров в ненарушенных и химически загрязнённых почвах. ПРоведена серия экспериментальных исследований по биотической оценке загрязненных тяжелыми металлами (ТМ) почв до и после применения ремедиантов в виде гуминовых продуктов и биоугля. Исследование влияния загрязнения ТМ в почвах разной гумусированности выявило эффект углеродсодержащих препаратов (биоуголь, лигногумат) на состояние их микробных сообществ. Структурные и функциональные микробные маркеры, выявленные методом МСТ, и содержание углерода микробной биомассы предоставляют большую информацию об изменении микробного сообщества почвы, в том числе и в условиях их загрязнения ТМ, по сравнению с дыхательной микробной активностью и показателем его экофизиологического состояния (Терехова и др., 2021 ; Microbiological Indicators of Heavy Metals and Carbon-Containing Preparations Applied to Agrosoddy-Podzolic Soils Differing in Humus Content. Terekhova V.A., Prudnikova E.V., Kulachkova S.A. et al. // Eurasian Soil Science,221. 54(3): 448-458 ) . А анализ фитоэффектов от добавок ТМ и рмедиантов в тех же почвах показал необходимость коррекции нормативов ОДК ТМ с учетом содержания органического углерода в почве ( Terekhova V.A., Prudnikova E.V., Kiryushina A.P., Karpukhin M.M., Plekhanova I.O., Yakimenko O.S. Phytotoxicity of Heavy Metals in Contaminated Podzolic Soilsof Different Fertility Levels/ Eurasian Soil Science, 2021. 54(6):964-974). В лаборатории разработаны несколько методик оценки токсичности, получены патенты, в т.ч. на способ анализа деструкционной активности микромицетов. Проводятся масштабные исследования почв разных типов, загрязненных в натурных условиях техногенными отходами предприятий металлургии, а также в серии модельных экспериментов. Результаты недавних экспериментов опубликованы в целом ряде статей.

Охарактеризована структура микобиоты в натурных и техногенных почвах, различающихся по содержанию тяжёлых металлов (ТМ) и доступных источников углеродного питания (Сорг.). Общую численность таксономических единиц, разнообразие, представленность меланинсодержащих микромицетов оценивали методами посева и с помощью высокопроизводительного секвенирования генома. В модельных мезокосмах с загрязненными и незагрязненными образцами агродерново-подзолистой почвы за трехмесячный период наблюдений выявлено около 60 видов, встречаемость которых сильно варьировала как по времени, так и в вариантах опыта. Наиболее часто встречались виды рода Talaromyces (T. minioluteus (Dierckx) Samson, Yilmaz, Frisvad & Seifert, T. pinophilus (Hedgc.) Samson, Yilmaz, Frisvad & Seifert, T. purpureogenus Samson, Yilmaz, Houbraken, Spierenburg, Seifert, Peterson, Varga & Frisvad, T. funiculosus (Thom) Samson, Yilmaz, Frisvad & Seifert), виды Trichoderma (T. atroviride P. Karst, T. harzianum Rifai, Acremonium roseolum (G. Sm.) W. Gams, Aphanocladium album (Preuss) W. Gams, Penicillium citrinum Thom, P. ochrochloron Biourge. Для выявления закономерностей в структуре и установления зависимости распределения меланизированных грибов от нагрузки и содержания углеродных питательных компонентов проведена статистическая обработка массива полученных данных, проведен корреляционно-регрессионный и факторный анализ. Переменными выступали: доля меланизированных видов, уровень Сорг., концентрации Cu, Zn, Pb и Cd. Статистический анализ данных и их визуализацию выполнен с помощью программ Excel, XLStat и R-Statistics. Индекс Шеннона и Серенсена рассчитывали в приложении Synecol. Аализ выявил рост меланинсодержащих грибов при повышении нагрузки ТМ. Традиционным методом посева почвенной суспензии установлено заметное влияние содержания Сорг. на увеличение численности КОЕ меланизированных форм в сформировавшейся микобиоте почв с ТМ. При этом в слабогумусированной почве (с относительно невысоким содержанием органического углерода (Сорг. = 1,3%) внесение ТМ привело к более значительному увеличению (на 38%), по сравнению с увеличением численности КОЕ меланизированных форм в сильногумусированной (Сорг. = 3,9), где оно не превышало 18%. В ходе молекулярно-генетического исследования методом высокопроизводительного секвенирования генома микобиоты агродерново-подзолистых почв с разным содержанием Сорг была выявлена 181 таксономическая единица, 98 из них (54%) удалось определить до уровня вида. Среди выявленных форм грибов большинство в обеих почвах относилось к отделу Ascomycota – 55 видов из 113 родов. В загрязнённых ТМ образцах доля аскомицетов немного увеличивалась. Индекс Шеннона по данным генетического анализа был высоким: в незагрязненной почве Ч1 – 4,59; в почве с тяжелыми металлами Ч1-ТМ – 4,55; в Ч2 – 4,62; Ч2-ТМ – 4,10. В слабо гумусированной почве (Ч2) внесение ТМ способствовало большему снижению разнообразия, чем в почве сильно гумусированной – Ч1. Индекс Сёренсена при попарном сравнении был следующим: Ч1-Ч2 – 0,36; Ч1-Ч1-ТМ – 0,84; Ч2-Ч2-ТМ – 0,37; Ч1-ТМ-Ч2-ТМ – 0,28. Эти величины свидетельствуют об изначальном различии сообщества грибов в незагрязнённых образцах агродерново-подзолистой почвы. Внесение же ТМ приводило к более заметному изменению структуры сообщества грибов в образцах почв с меньшим содержанием Сорг. (0,37 для пары Ч2 и Ч2-ТМ), по сравнению с сильно гумусированными образцами (0,84 для пары Ч1 и Ч1-ТМ). Факторный анализ и метод кластеризации показал, что отличие микобиоты сильно гумусированных образцов ( Ч1 и Ч1-ТМ) от второй пары образцов определяется присутствием родов Gibberella, Plectosphaerella и Acremonium. Уникальность образца Ч2 определяется наличием представителей семейства Aspergillaceae, родов Tetracladium, Fusarium, Trichoderma и других. А микобиоту Ч2-ТМ отличали представители семейств Didymellaceae и Clavicipitaceae, а именно рода Metarrhizium, включающего энтомопатогенные грибы. Заметную часть аскомицетной микобиоты составляют меланинпродуцирующие виды. Сопоставление меланизированных форм грибов, выявленных методами посева и секвенирования генома, показало явное увеличение доли меланинсодержащих грибов после внесения ТМ по результатам анализа культивируемых форм: в сильно гумусированной почве (Ч1) на 18% и слабо гумусированной (Ч2) на 38%. По данным генетического анализа в Ч1 доля меланинсодержащих грибов после внесения ТМ также увеличилась на 7%, но в почве Ч2 снизилась на 9%, что может быть связано с развитием более устойчивых видов с гиалиновым мицелием. При сравнении индексов разнообразия, полученных при анализе микобиоты двумя методами, ожидаемо казалось, что разнообразие по результатам метагеномного анализа для всех образцов значительно (в 4–6 раз) выше, чем по результатам посева. Такое расхождение в значениях объясняется тем, что лишь небольшая часть (около 1%) почвенных микроорганизмов могут быть выделены на питательные среды с использованием традиционных микологических методов. В итоге проведенной работы установлена значимая зависимость меланизированных форм не только от присутствия ТМ, но и от уровня углеродных компонентов питания: ТМ в большей степени оказывают влияние на структуру микобиоты в почвах с более низким содержанием Сорг. Полученные данные подтверждают положение о том, что в обеднённых углеродным питанием субстратах меланинообразование способствует повышению резистентности к окислительно-восстановительным стрессам. Метод высокопроизводительного секвенирования генома почвенных грибных сообществ нагляднее показал изначальные различия сообществ грибов в незагрязнённых образцах агродерново-подзолистой почвы с разным содержанием Сорг. Внесение ТМ приводило к более заметному изменению структуры сообщества грибов в образцах почв с меньшим содержанием Сорг. (индекс Серенсена 0,37 для пары Ч2 и Ч2-ТМ), по сравнению с сильно гумусированными образцами (0,84 для пары Ч1 и Ч1-ТМ). В тоже время, этот метод недостаточно информативен для решения экологических мониторинговых задач на основе микоиндикации, он не обнаружил преимуществ перед методом посева по выявлению факторов влияния на представленность меланизированных форм в почвенных субстратах с разным содержанием Сорг.. В данной работе была использована лишь одна традиционно рекомендуемая для выделения почвенного неспецифического сапротрофного комплекса - питательная среда Чапека, на которой не выделяются микоризообразующие и паразитирующие грибы. Выявленное в сравнительных испытаниях с метагеномным анализом преимущество метода посева даже в таком случае дает основание рекомендовать его для мониторинга химического загрязнения почв. С помощью метода посева быстро и без значительных затрат можно характеризовать динамику меланизированных форм при разной техногенной нагрузке. Оценка токсичности почвенных образцов загрязненных высокими дозами ТМ выполнена по изменению субстрат-индуцированного дыхания (СИД) и расчету микробной биомассы (Смик) в почвах разного гумусного статуса показала заметное угнетение метаболической активности сообществ. При этом микробная активность в богатой гумусом почве (Ч1) снижалась в присуствии ТМ на 20 %, а в бедной (Ч2) – на 40%. Водные экстракты образцов с ТМ как слабо, так и сильно гумусированных бразцов, губительно действовали на стандартизованную тест-культуру ракообразных, вызывая гибель от 30 до 90 %. Их влияние на развитие проростков семян горчицы белой S. alba было не столь значительным. Исследования в этом направлении будут продолжены на втором этапе проекта. Выявлена индикаторная значимости меланинсодержащих микромицетов в разных почвенных условиях. Сделан вывод о большей биоиндикационной информативности метода микробиологического посева перед пока еще дорогостоящим метагеномным секвенированием, и эффективности его применения в экомониторинге химического загрязнения почв. По итогам анализа литературы опубликован обзор, в котором обоснована необходимость комплексной оценки средств ремедиации почв, в частности, гуминовых продуктов. Таким образом, к концу первого года выполнения проекта в ходе микологических анализов почв культуральным и молекулярно-генетическим способами выявлены особенности структуры микобиоты, охарактеризована встречаемость меланизированных форм микромицетов в образцах, различающихся по содержанию органического углерода и уровню загрязнения тяжелыми металлами, определена токсичность почвенных образцов, выполнена статистическая обработка экспериментальных данных . Защищены 2 магистерские диссертации, подготовлены 2 статьи в резензируемых журналах (индексируемых в WoS и Scopus) и 2 статьи в изданиях, индексируемых в РИНЦ , сделано 5 докладов, включая приглашенные, на российских и международных конференциях, в том числе, 3-х молодежных.