![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Герпесвирусы широко распространены в человеческой популяции и являются возбудителями инфекций, передающихся половым путем. В последнее время появились работы, указывающие на связь герпесвирусных инфекций с бесплодием, однако много вопросов в этой области остаются нерешенными. Так, отсутствуют или крайне ограничены данные о возможности заражения зрелых сперматозоидов герпесвирусами и о влиянии вирусной инфекции на морфофункциональные характеристики мужских гамет. Не доказано также проникновение герпесвирусов в ооциты при оплодотворении инфицированными гаметами. Задача проекта состоит в экспериментальной оценке экспрессии вирусного генома в сперматозоидах человека; в исследовании возможности вертикальной передачи герпесвирусов с мужскими гаметами; в изучении связи между внутригаметной герпесвирусной инфекцией и мужской фертильностью. Для решения поставленных задач будет создана модель инфицирования человеческих сперматозоидов герпесвирусами in vitro с последующим оплодотворением ооцитов мыши. Для выяснения связи герпесвирусной инфекции сперматозоидов с мужским бесплодием будет проведено сравнительное исследование частоты встречаемости герпесвирусов и количественный анализ вирусной нагрузки в группах фертильных мужчин и пациентов с идиопатическим бесплодием. В работе будет использован комплекс современных методов вирусологии, клеточной и молекулярной биологии, в том числе: ДНК-гибридизация in situ, иммуноцитохимия, конфокальная и электронная микроскопия, ПЦР в реальном времени и количественный вирусологический анализ.
В результате выполнения проекта планируется изучить факторы, определяющие эффективность заражения и разработать модель герпесвирусного инфицирования сперматозоидов человека in vitro. С помощью полученной модели будет изучено взаимодействие герпесвирусов со сперматозоидами: адсорбция, слияние мембран, проникновение в клетку. Изучение экспрессии вирусных генов, кодирующих белки IE, E и L, позволит оценить форму вирусной инфекции мужских гаметах (латентная, абортивная, литическая). Оплодотворение яйцеклеток in vitro инфицированными сперматозоидами впервые покажет вероятность вертикальной передачи герпесвирусов с мужскими гаметами в прямом эксперименте и сделает возможным изучение влияния герпесвирусов на ранние стадии эмбрионального развития. Будут получены данные о частоте встречаемости 5 герпесвирусов (ВПГ1, ВПГ2, ЦМВ, ГВЧ-6 и ВЭБ) в клеточной фракции эякулята фертильных мужчин и пациентов с бесплодием, что позволит сделать вывод о существовании связи между герпесвирусным инфицированием эякулята и мужским бесплодием.
Коллектив исследователей имеет опыт работы, необходимый для решения поставленных в проекте задач. Проведен сравнительный анализ частоты встречаемости ВПГ и ЦМВ в эякулятах 675 мужчин с бесплодием и практически здоровых лиц. Было показано, что инфекционно-активный ВПГ чаще встречается у пациентов с бесплодием, чем у здоровых лиц как в цельном эякуляте, так и во фракции подвижных сперматозоидов. Разработана экспериментальная модель для изучения действия герпесвирусов на сперматогенез – органная культура семенника мыши и яичка человека in vitro. Определена динамика и уровень экспрессии вирусных ДНК и белков на различных стадиях цитодифференцировки половых клеток, установлена различная чувствительность половых клеток к вирусной инфекции, показан гаметотоксический эффект герпесвирусов. Заражение органной культуры семенников неполовозрелых мышей показало, что в основе патогенного воздействия на половые клетки мужских гонад лежит подавление дифференцировки половых клеток, блокирование мейоза и гибель сперматогенных клеток. Применен оригинальный метод введения ВПГ в семенники мыши через rete testis, имитирующий ретроградный путь заражения мужских половых органов. Показано, что даже при низкой инфицирующей дозе герпесвирусная инфекция вызывает орхит и дегенерацию половых и соматических клеток семенника, что неизбежно приводит к бесплодию. Проведены опыты по выяснению возможности заражения мужских половых клеток в раннем возрасте, до полового созревания и формирования ГТБ. Мышей-самцов препубертатного возраста заражали ВПГ внутрибрюшинно и установили, что вирус способен инфицировать клетки семенника. В половозрелом возрасте самцов, инфицированных на 8-й день жизни, спаривали с неинфицированными самками, что позволило установить снижение фертильности в исследованной группе животных по сравнению с контролем. Тем самым впервые получены прямые данные, свидетельствующие о вкладе ВПГ в развитие мужского бесплодия.
В Проекте проведен сравнительный анализ частоты встречаемости ДНК 5 герпесвирусов человека (ГВЧ): ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВГЧ-6, ВЭБ – в эякулятах 549 пациентов с заболеваниями мочеполовой системы. Установлено, что частота встречаемости вирусных ДНК всех изученных ГВЧ суммарно составила 16,4%. Реже других ГВЧ встречались ВПГ-1 и/или ВПГ-2 (ВПГ-1/2) – 0,43%, частота встречаемости ЦМВ составила 4,4%, ВГЧ-6 – 6,6%, ВЭБ – 2,9%. ГВЧ чаще всего выявляли в эякулятах пациентов с воспалительными заболеваниями половой системы, а также у пациентов с идиопатическим бесплодием, причиной которого также могут являться воспалительные процессы. Показано, что вирусная ДНК, в случае ВЭБ и ЦМВ, почти в два раза чаще ассоциирована со сперматозоидами, чем с семенной жидкостью. Наличие ДНК ГВЧ в эякулятах ассоциировалось с уменьшением концентрации сперматозоидов и снижением количества морфологически нормальных форм гамет у пациентов с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта. Негативные изменения были более выражены в присутствие ДНК ЦМВ по сравнению с другими ГВЧ. В образцах, содержащих ДНК ЦМВ, иммунофлуоресцентным методом выявлен вирусный антиген, который локализован в области шейки сперматозоида, а также в пришеечной и в экваториальной частях головки. Для более подробного изучения взаимодействия ГВЧ с мужскими гаметами разработана модель инфицирования сперматозоидов человека in vitro. По данным иммунофлуоресцентного анализа вирусных антигенов, при инкубации сперматозоидов с ЦМВ инфицируется только около 2% гамет, в то время как при заражении ВПГ-1 инфицированными оказываются 17.26±2.58% клеток. Установлено, что вирусные белки локализуются в тех же участках гамет, что и в образцах пациентов, положительных на ГВЧ. Показано, что инфицирование гамет in vitro не снижает их подвижности. На модели пенетрации ооцитов золотистого сирийского хомячка сперматозоидами человека in vitro показана принципиальная возможность вертикальной передачи ГВЧ при оплодотворении от сперматозоидов к зиготе.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2015 г. | Экспериментальный анализ взаимодействия герпесвирусов со сперматозоидами и оценка его последствий для фертильности |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".