ИСТИНА

Шаперонины – один из важнейших классов молекулярных шаперонов, которые обеспечивают правильное сворачивание белков как in vivo, так и in vitro, и найдены в прокариотах, эукариотах и археях. Предлагаемый проект посвящен изучению обнаруженной нами новой группы шаперонинов – шаперонинов, кодируемых бактериофагами, и является продолжением исследований, проводимых в 2011-2013 гг. в рамках гранта РФФИ (№ 04-11-00935). Ранее нами получены данные по характеристике и свойствам шаперонина, кодируемого геномом бактериофага EL P. aeruginosa, – продукта гена 146 (gp146). В предлагаемом проекте мы планируем получить и охарактеризовать с помощью различных физико-химических методов (электронная микроскопия, аналитическое ультрацентрифугирование, дифференциальная сканирующая калориметрия, изотермическое калориметрическое титрование, флуоресцентная спектроскопия, спектроскопия кругового дихроизма) другой представитель этой группы шаперонинов, кодируемый бактериофагом OBP P. fluorescence. Будет проведен сравнительный анализ его свойств со свойствами ранее изученного gp146 фага EL. Основными задачами исследования являются выяснение роли шаперонинов, кодируемых бактериофагами, в процессе морфогенеза фаговых частиц, а также детальное изучение их функционального цикла. Мы планируем получить и изучить комплексы фаговых шаперонинов как с низкомолекулярными лигандами (АТФ, АДФ, негидролизуемые аналоги АТФ), так и с белками-субстратами в различных конформационных состояниях, соответствующих разным стадиям АТФазного цикла, и выяснить их структуру. Полученные данные позволят выявить характерные особенности, присущие новой группе шаперонинов – фаговым шаперонинам, и определить их место в структурной и функциональной классификации известных на сегодняшний день шаперонинов.

Цель предлагаемого проекта – изучение характерных особенностей, свойств и механизма функционирования новой обнаруженной нами группы шаперонинов – шаперонинов, кодируемых бактериофагами. Основные задачи нашего исследования: 1. Разработать систему экспрессии гена 246 фага ОВР, кодирующего шаперонин, в клетках E. coli. Выяснить архитектуру и определить количество субъединиц в олигомерном рекомбинантном белке. 2. Идентифицировать белки-субстраты шаперонина фага ОВР и разработать систему экспрессии кодирующих их генов в клетках E. coli. Используя рекомбинантные белки, изучить влияние шаперонина на термическую агрегацию субстратов, а также провести опыты по рефолдингу их денатурированных форм в присутствии шаперонина. Провести сравнительный анализ свойств шаперонинов из разных фагов. 3. Выяснить роль шаперонинов в процессе морфогенеза фаговых частиц. Для этого мы планируем получить ряд температурочувствительных мутантов фагов OBP и EL, а также фаги, различающиеся по морфотипу негативных колоний. Выявить и изучить мутантные фаги, утратившие способность синтезировать фаговые шаперонины при размножении в бактериальных клетках. 4. С целью выяснения механизма функционирования фаговых шаперонинов мы планируем изучить шаперонины как в свободном состоянии (апо-форма), так и в виде комплексов с нуклеотидами (АТФ, АДФ, различные негидролизуемые аналоги АТФ). Получить комплексы шаперонинов с субстратами в различных конформационных состояниях, соответствующих разным стадиям функционального цикла, выяснить их структуру.

Ранее нами впервые были получены экспериментальные доказательства функционирования в качестве шаперонина GroEL-подобного белка, кодируемого геном 146 бактериофага EL P. aeruginosa. В рамках данного проекта получен и охарактеризован другой предполагаемый шаперонин, кодируемый геном 246 фага ОВР P. fluorescens. В отличие от характерной двухкольцевой архитектуры большинства шаперонинов, включая шаперонин EL, рекомбинантный продукт гена (пг) 246 ОВР, продуцируемый клетками E. coli, собирается в одинарные гептамерные кольца. Подобно шаперонину EL, он обладает АТФазной активностью и функционирует без кошаперонина. В опытах in vitro установлено, что пг246 защищает фаговые эндолизины от термоинактивации и подавляет агрегацию частично развернутых под воздействием температуры молекул субстратов АТФ-зависимым способом. Методами калориметрии изучено взаимодействие шаперонина ОВР с нуклеотидами (АТФ, АДФ, негидролизуемые аналоги АТФ: AMP-PNP и АТФ-гамма-S) при разных температурах и влияние связанных нуклеотидов на термическую денатурацию образующихся комплексов. На основе статистического анализа и классификации изображений, полученных с помощью электронной микроскопии для негативно контрастированных образцов пг246 в свободном виде и в комплексах с разными нуклеотидами, выявлены различные конформационные состояния шаперонина, которые, по-видимому, соответствуют разным стадиям его АТФазного цикла. В комплексе с АТФ шаперонин имеет открытую конформацию, а в комплексе с АДФ – закрытую. С разрешением 14 A реконструирована модель шаперонина ОВР в открытой конформации. В сотрудничестве с американскими коллегами из Техасского университета на основе криоэлектронных изображений реконструированы модели шаперонина EL в апо-форме и в комплексах с АТФ и АДФ. Установлено, что в присутствии АДФ тетрадекамерный шаперонин EL диссоциирует на два гептамерных кольца. C помощью методов биоинформатики проведено сравнительное исследование последовательностей шаперонинов EL и ОВР, а также еще 8 выявленных по базам данных потенциальных фаговых шаперонинов как между собой, так и с последовательностями более 100 других известных шаперонинов из бактерий, архей и эукариот. По результатам множественного выравнивания выбранных последовательностей установлено, что фаговые шаперонины из-за низкой консервативности достаточно сложно выделить в монофилетическую группу. Они больше похожи на бактериальные шаперонины по своей архитектуре и наличию характерных консервативных участков, и на филогенетическом древе также расположены среди шаперонинов I группы. Однако, как и шаперонинам II группы, для функционирования им не требуются кошаперонины. Важной особенностью фаговых шаперонинов является очень низкая консервативность сегмента C-концевого домена, отвечающего за взаимодействие между кольцами. С помощью гомологичного моделирования установлена разница в структуре межкольцевых контактов для тетрадекамерного шаперонина EL и гептамерного ОВР, определяющая их олигомерное состояние.