ИСТИНА

Проект направлен на решение фундаментальной проблемы, связанной с устойчивостью и гомеостазом генома, а также приобретением им новых структурных элементов и свойств, и посвящен изучению молекулярных механизмов регуляции транспозиции ретротранспозонов - эндогенных ретровирусов беспозвоночных (эррантивирусов). На модельном объекте - Drosophila melanogaster - исследуется влияние ретроэлементов на функционирование и эволюцию хозяйского генома, саморегуляция активности ретроэлементов и регуляция за счет хозяйских генов, а также исследуется вопрос о роли доместицированных генов ретроэлементов в хозяйском геноме.

The project is aimed at solving the fundamental problems related to the stability and homeostasis of the genome, as well as the purchase of new structural elements and properties, and devoted to the study of molecular mechanisms regulating transposition of retrotransposons - endogenous retroviruses of invertebrates (orantiviruses). Using a model object Drosophila melanogaster we examine the impact of retroelements on the functioning and evolution of the host's genome, self-regulation of the activity of retroelements and regulation at the expense of the host genes, and also investigate the question of the role of domesticated genes of retroelements in the host genome.

1. Разработать детальные схемы всех экспериментов, отработать и модифициро вать под конкретные цели генетические, молекулярно-генетические, генно-инженерные, биохимические и биоинформатические методы исследований. 2. Создать необходимые молекулярные конструкции и сконструировать необходимые линии дрозофилы, необходимые для проведения исследования. 3. Секвенировать и проанализировать транскриптомы как минимум трех линий дрозофилы с нарушенным контролем транспозиции ретроэлемента gypsy, имеющих фенотип flamenco (flamenco - один из локусов, контролирующих транспозиции ретроэлемента gypsy), а также контрольных линий: дикого типа и линии piwi3 - с нарушенной работой piwi-зависимой системой РНК-интерференции. 4. Осуществить поиск мутаций в геномах мух из коллекции лабораторных линий дрозофилы, имеющих фенотип flamenco, и установить принадлежность мутаций к локусу flamenco или другим генам. 5. Провести сравнительный анализ физиологических и поведенческих особенностей линий дрозофилы, имеющих фенотип flamenco (SS и MS) и линий дикого типа, в том числе исследовать продолжительность жизни, плодовитость и двигательную активность. 6. Получить гибриды линий дикого типа и flamenco, изучить у гибридов экспрессию генов-кандидатов, участвующих в формировании фенотипа flamenco и провести сравнительный анализ физиологических и поведенческих особенностей полученных гибридов и родительских линий. 7. Исследовать механизмы молекулярной доместикации генов gag и env ретровирусов на примере генов дрозофилы Grp и Iris - доместицированных генов gag и env эррантивирусов - и проанализировать их возможные клеточные функции, в том числе установить клеточную локализацию кодируемых ими белков. 8. Исследовать генетические эффекты стрессовых факторов, влияющих на транскрипцию генов Grp и Iris. 9. Исследовать возможную роль гена Grp в индукции врожденного иммунитета (данные получены в ходе ранее проведенных исследований) против бактериальной инфекции, предполагается использовать различные штаммы бактерий и компоненты бактериальной стенки. 10. Получить трансгенную линию дрозофилы с инактивированным геном Grp и исследовать транскриптом у полученной мутантной линии. 11. Получить трансгенную линию дрозофилы с оверэкспрессированным геном Grp и исследовать транскриптом у полученной мутантной линии.

Получена оригинальная система длительной генетической нестабильности дрозофилы MS-SS, в которой происходит транспозиция лишь одного семейства ретротранспозонов – gypsy (МДГ4). Установлено, что генетическая нестабильность и транспозиции gypsy обусловлены присутствием в геноме особых «активных» копий элемента. Транспозиция gypsy обуславливает повышенные темпы как спонтанного, так и индуцированного мутагенеза в половых и соматических клетках дрозофилы. В линиях MS и SS идентифицирован ген регуляции транспозиции МДГ4 – flamenco. Разработан гибридологический метод прижизненной регистрации транспозиционной активности gypsy - тест ovoD. Имеется необходимый коллекционный и методический материал для проведения работ по проекту, необходимые молекулярные зонды для изучения транспозиции открытых недавно ретротранспозонов ZAM, Idefix, Tirant, 17.6, 297, rover, Quasimodo, Springer, opus. Клонирован фрагмент второй открытой рамки считывания gypsy, кодирующий интегразу. Исследована специфичность интеграции ретротранспозонов D. melanogaster и структура гена DIP1. Показано, что наличие мутантных свойств flamenco коррелирует с инсерцией в этот ген мобильного элемента НВ. Обнаружены и клонированы гены хозяйского генома Grp и Iris, гомологичные генам gag и pol ретротранспозона gypsy. Показано, что ген Grp в геномах видов рода Drosophila находится под действием стабилизирующего отбора и выполняет высоко консервативную функцию. Ген Grp индуцируется бактериями рода Bacillus и ретровирусом gypsy, а ген Iris не принимает участия в иммунитете. Проведены работы по изучению эволюции ретротранспозонов методами биоинформатики. Обнаружено, что линия SS характеризуется повышенным уровнем экспрессии локуса flamenco, что свидетельствует о нарушении процессинга транскриптов локуса и позволяет предполагать наличие мутации в гене одного из белков, участвующих в этом процессе. Обнаружение этой мутации может пролить свет на неизвестный на данный момент механизм процессинга piRNA.

1. Будут разработаны детальные схемы всех запланированных экспериментов. 2. Будет выполнено секвенирование транскриптомов мух линий Drosophila с фенотипом flamenco: SS,MS, SSw1, oregon и гомозигот по мутации piwi3. 3. Будет проведен сравнительный анализ транскриптомов дрозофил линий SSw1, oregon, piwi3,SS и MS. Предполагается выявить черты сходства и различия в профиле экспрессии генов у различных линий дрозофилы с нарушенным контролем экспрессии ретроэлементов. 4. Будет разработано программное обеспечение для поиска нонсенс-мутаций в массиве данных секвенирования геномов. 5. Будет осуществлен поиск нонсенс-мутаций у исследуемых линий дрозофилы. Если такие нарушения будут найдены, взаимосвязь этих генов со статусом flamenco будет про верена гибидологическими методами, а также методом ПЦР. 6. На основе данных секвенирования предполагается создать базу данных однонуклеотидных полиморфизмов, различающихся между исследуемыми линиями дрозофилы. Эта информация будет использоваться при гибридологическом анализе этих линий. 7. Будет проведено сравнение физиологических и поведенческих особенностей дрозофил линий SS, MS и дикого типа. Предполагается исследовать продолжительность жизни, плодовитость и двигательную активность дрозофил линий SS, MS и дикого типа. 8. Будет проведен гибридологический анализ как минимум двух поколений потомства от скрещивания этих линий с фенотипом flamenco и дикого типа. Фенотип гибридов будет проанализирован комплексно: предполагается исследовать экспрессию ретроэлементов, продолжительность жизни и другие характеристики, по которым будут обнаружены различия при выполнении п. 5 и 7. 9. Будут получены трансгенные линии дрозофилы с увеличенной и, наоборот, подавленной экспрессией гена Gagr и проведено исследование их фенотипических особенностей. 10. Будет расширен список патогенов для тестирования их способности индуцировать экспрессию гена Gagr. Для патогенов, индуцирующих Gagr, будут испытаны способы введения путем интраабдоминальной инъекции и через желудочно-кишечный тракт