|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Изучение противоопухолевой активности и иммуномодуляторного действия селективных лигандов мембранных рецепторов прогестеронаНИР
Studying the antitumor and immunomodulatory activities of selective ligands of membrane progesterone receptors
- Руководитель НИР: Щелкунова Т.А.
- Ответственные исполнители: Гончаров А.И., Гусева А.А., Левина И.С., Маслакова А.А., Поликарпова А.В.
- Подразделение: Биологический факультет
- Срок исполнения: 7 апреля 2017 г. - 31 декабря 2019 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 17-04-00234а
- Номер ЦИТИС: ÀÀÀÀ-À17-117040710069-2
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Физиологические механизмы деятельности, развития и устойчивости организма человека и животных
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.15.41 Молекулярная эндокринология
-
Ключевые слова:
селективные лиганды мембранных рецепторов прогестерона, цитокины, рецепторы, экспрессия, апоптоз, лимфоциты, канцерогенез
selective ligands, the antitumor and immunomodulatory activities, receptors, progesterone -
Описание:
Прогестины, включающие природный гормон прогестерон и его синтетические аналоги, активно используются в контрацепции и лечении гинекологических расстройств. Эти стероидные гормоны оказывают свои эффекты через ядерные рецепторы, являющиеся лиганд-зависимыми транскрипционными факторами (nPRs); через разные субтипы мембранных рецепторов (mPRs), относящихся к семейству адипониктиновых (PAQR)-рецепторов, а также через различные сенсоры. Показано, что в зависимости от структуры стероида и от его концентрации активируются разные типы рецепторов, запускающих разнообразные сигнальные пути в клетках, которые определяют множественные эффекты этих гормонов. Поскольку такие эффекты в зависимости от типа активируемого рецептора специфичны и иногда даже разнонаправлены, важной задачей является поиск соединений, являющихся селективными лигандами определенного типа рецепторов. Механизм действия прогестинов через mPRs мало изучен, но есть данные о их важной роли в регуляции процессов жизнедеятельности клеток. В результате предварительной работы среди ряда синтезированных в ИОХ аналогов прогестерона мы нашли 2 селективных лиганда mPRs, относящихся к 3-дезоксосоединениям. В проекте предполагается изучить эффекты этих селективных лигандов на процессы пролиферации и апоптоза в клетках линии ВхРС3 аденокарциномы поджелудочной железы, экспрессирующей только мембранные рецепторы, исследовать сигнальные пути, активируемые прогестинами через индивидуальные субтипы mPRs (альфа, бета, гамма) путем трансфекции клеток, не содержащих PRs, плазмидными векторами с генами этих белков и изучения действия ингибиторов киназ и уровней вторичных мессенджеров. Планируется также изучить эффекты прогестерона и двух 3-дезоксосоединений на экспрессию различных цитокинов про- и антивоспалительного действия на уровне мРНК и белка в мононуклеарных клетках крови и в культурах иммунных клеток человека. В результате этой работы заявители ожидают выявить роль mPRs в противоопухолевом действии прогестинов, обнаружить посредников этого действия; установить значение mPRs в иммуномодуляторном действии и возможность использования их селективных лигандов в лечении онкологических заболеваний и болезней, связанных с неадекватной иммунной реакцией и осложнениями беременности. Ожидается, что новые соединения смогут оказывать узкоспецифическое действие без побочных эффектов, вызываемых активацией nPRs.
-
Abstract:
Progestins, including the natural hormone progesterone and its synthetic analogues, are actively used in contraception and in the treatment of gynecological disorders. These steroid hormones exert their effects through nuclear receptors that are ligand-dependent transcription factors (nPRs)and through different subtypes of membrane receptors (mPRs) that belong to the family of adiponictin (PAQR) receptors. It is shown that the structure of the steroid and its concentration determine the activation of different types of receptors and the multiple effects of these hormones, triggering a variety of signaling pathways in cells. Since progestins effects are specific and sometimes even multidirectional depending on the type of activated receptor, an important task is the search for compounds that are selective ligands of a certain type of receptor. The mechanism of progestins action through mPRs has not been studied enough. But there is evidence of their important role in the regulation of cellular life processes. As a result of preliminary work, among the series of progesterone analogues we found 2 selective ligands of mPRs that belong to 3-deoxo compounds. In the project we study the effects of these selective ligands on the processes of proliferation and apoptosis in the cells of the BXRS3 line of pancreatic adenocarcinoma, which expresses only the mPRs. Our goals are to investigate the signaling pathways activated by progestins through individual subtypes of mPRs by transfection of cells lacking PRs by plasmid vectors with the genes of these proteins; to study the action of kinases inhibitors and to estimate the levels of secondary messengers. It is also planned to study the effects of progesterone and two 3-deoxo compounds on the expression of various pro- and anti-inflammatory cytokines at the level of mRNA and protein in mononuclear blood cells and in human immune cell cultures. As a result of this work, we expect to identify the role of mPRs in the antitumor effect of progestins, to discover the mediators of this action; to establish the value of mPRs in immunomodulatory action. We will explore the possibility of using our selective ligands in the treatment of cancer and diseases associated with inadequate immune response and complications of pregnancy.
-
Планируемые результаты:
К концу 2017 года будут изучены эффекты разных доз 19-гидроксипрегн-4-ен-20-она и 19-гидроксипрегн-3-ен-20-она на пролиферацию клеток BxPC3 аденокарциномы поджелудочной железы человека в XTT (Cell Proliferation Assay) и экспрессию связанных с ним генов (маркеров пролиферации Ki67, PCNA, а также циклина D1, ингибиторов циклинзависимых киназ р21 и р27) методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Будут подобраны условия и произведена трансфекция экспрессионными плазмидными векторами, несущими гены mPRs (alpha, beta, gamma) человека и вектором без вставки, клеток линии LNCaP аденокарциномы простаты человека. Будет изучена экспрессия этих генов в трансфецированных клетках. В клетках THP1 (моноциты) и K562 (лимфобласты) будет изучена экспрессия мРНК mPRs и nPRs. Будут подобраны условия стимуляции разных иммунных клеток для продукции цитокинов. Начнется изучение влияния прогестерона и 3-дезоксосоединений на продукцию мРНК этих цитокинов.
-
Научный задел:
В результате предварительно проведенного зондирования лиганд-связывающих карманов разных типов рецепторов прогестерона, в ИОХ им.Н.Д.Зелинского под руководством И.С.Левиной была синтезирована новая серия прогестинов, которые имели структуру, предположительно наиболее избирательно взаимодействующую с mPRs. Среди них 2 соединения, 19-гидроксипрегн-4-ен-20-он (I) и 19-гидроксипрегн-3-ен-20-он (II), обладали достаточным сродством к mPRs и не связывались с nPRs, то есть являлись селективными лигандами.Найдены подходящие объекты исследования действия прогестинов, опосредуемых mPRs, а также пригодные для экспрессии этих рецепторов индивидуально по отдельным субтипам. Прогестерон, как нами было показано, ингибировал пролиферацию опухолевых клеток BxPC3.Коллектив владеет всеми необходимыми методами исследований, включая работу с культурами клеточных линий млекопитающих, ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени, иммуноблоттинг, иммуноферментный анализ и другие, которые адекватны поставленным задачам.
-
Основные результаты:
В результате этой работы заявители ожидают что новые селективные в отношении мембранных рецепторов прогестерона лиганды I и II в физиологических дозах будут ингибировать пролиферацию и стимулировать апоптоз клеток линии ВхРС3 аденокарциномы поджелудочной железы в отличие от высоких доз прогестерона, поскольку синтетические стероиды как правило, слабо метаболизируются в тканях. Мы ожидаем получить 4 пула клеток линии LNCaP аденокарциномы простаты человека с хорошим уровнем экспрессии разных субтипов mPRs (alpha, beta, gamma) и без экспрессии (после трансфекции вектором без вставки). В этих клетках, измеряя уровень цАМФ методом EIA на фоне и в отсутствие коклюшного токсина, мы предполагаем обнаружить, какие субтипы mPRs связаны с ингибиторными G белками, а какие имеют другой механизм действия. Изучение эффектов селективных лигандов mPRs на пролиферацию на фоне ингибиторов различных сигнальных путей, как ожидается, позволит узнать о проведении гормонального сигнала, опосредуемого каждым из трех субтипов этих рецепторов и позволит выявить мишени их действия в клетке, которые могут служить объектами противоопухолевого терапевтического воздействия. Ожидается, что в РВМС доноров и клеточных линиях Jurkat, THP1 и K562 будут подобраны подходящие стимуляторы, вызывающие секрецию важных про- и антивоспалительных факторов, на фоне которых предполагается обнаружить действие селективных лигандов mPRs наряду с действием прогестерона на мРНК и белки этих цитокинов. Оригинальность результатов обусловлена новизной соединений, используемых в работе, высокой избирательностью их взаимодействия с mPRs, а также ранее неизученными объектами исследований, которые будут проводиться современными, адекватными поставленным задачам методами.
- Добавил в систему: Щелкунова Татьяна Анатольевна
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 7 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Изучение противоопухолевой активности и иммуномодуляторного действия селективных лигандов мембранных рецепторов прогестерона |
| Результаты этапа: Настоящий проект посвящен изучению эффектов и механизмов действия 2х селективных лигандов mPRs, относящихся к 3-дезоксосоединениям: 19-гидроксипрегн-4-ен-20-она (I) и 19-гидроксипрегн-3-ен-20-она (II). За 2017год мы изучили агонистическую и антагонистическую активности этих соединений как в отношении nPR-В, так и в отношении mPRalpha, экспрессированных в клетках дрожжей. В отношении mPRalpha была выявлена агонистическая активность и отсутствие антагонистической активности у обоих соединений. При этом было показано, что они не активируют и не подавляют транскрипционную активность nPR-В. По результатам работы написана статья, которая принята в печать в журнал «Биохимия». Нами впервые исследовано действие соединений I и II в трех дозах на пролиферацию клеток линии ВхРС3 аденокарциномы поджелудочной железы с помощью ХТТ-теста, а также влияние двух ингибиторов МАРК (р38 и JNK) на эффекты этих соединений. Соединение I, как и прогестерон, оказалось способно оказывать антипролиферативное действие на изучаемые опухолевые клетки особенно эффективно при подавлении активности р38 МАРК. Посредником его действия на жизнеспособность клеток, является JNK. При ингибировании активности этой киназы эффект соединения I полностью исчезает. Соединение II оказалось малоэффективным в изучаемом тесте. Сделана трансфекция клеток линии LNCaP векторными конструкциями, несущими гены mPRalpha, beta, gamma человека и вектор без вставки. Показан высокий уровень экспрессии мРНК этих рецепторов в данных клетках. Для изучения иммуномодуляторного действия прогестерона и селективных лигандов mPRs I и II исследована экспрессия мРНК nPRs и mPRs в 2х клеточных линиях – ТНР-1 и К562. Изучено действие соединений I и II и прогестерона на экспрессию мРНК IL-2, IL-10, TGF beta и TNF alpha в клеточной культуре Jurkat – Т-клеточной лейкемии человека. Прогестины через mPRs разных субтипов в этих клетках подавляют экспрессию провоспалительных факторов TNF alpha и IL-2, стимулируя экспрессию IL-10 и не влияя на TGF beta. По материалам этой работы был сделан стендовый доклад на международной конференции FEPS в сентябре 2017 года. | ||
| 2 | 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. | Изучение противоопухолевой активности и иммуномодуляторного действия селективных лигандов мембранных рецепторов прогестерона |
| Результаты этапа: Эффекты прогестерона и его синтетических производных опосредуются активацией разных типов рецепторов и сенсоров, главными из которых являются ядерные и разные субтипы мембранных рецепторов (mPRs). Среди синтезированных производных прогестерона нам удалось выявить два селективных лиганда mPRs (соединения I и II), механизмы действия которых и эффекты изучаются в данном проекте. В прошлом году было выявлено ингибирование пролиферации клеток ВхРС3 прогестероном и соединением I. В этом году изучались конкретные мишени действия этих стероидов среди генов, связанных с пролиферацией клеток. Соединение II было неэффективно в этих исследованиях. Было обнаружено, что прогестины изменяют экспрессию генов маркеров пролиферации Ki67, PCNA, а также циклина D1и ингибитора циклин-зависимых киназ р21. JNK участвует в сигнальных путях активированных mPRs в отношении экспрессии генов PCNA, циклина D1и р21. МАРК р38 мешает ингибированию пролиферации стероидами, осуществляемому через mPRs. Также в этом году исследовались эффекты прогестерона и соединений I и II на экспрессию генов, связанных с процессом апоптоза. Наиболее значительно изменяло экспрессию этих генов соединение II, в отличие от его действия на пролиферацию. Прогестерон и соединение I из 14 изучаемых генов снижали экспрессию антиапоптотического фактора BCL2A1. В то же время соединение II повышало уровень мРНК проапоптотических факторов каспазы 9, DAPK (Death-associated protein kinase 1), HRK (harakiri, BCL2 interacting protein), а на фоне ингибитора МАРК р38 еще и каспазы 3, BAD, BAX. Активность МАРК р38, по-видимому, препятствует сигнальным путям, активируемым mPRs под действием соединения II. JNK также не является посредником действия этого стероида на экспрессию генов, связанных с апоптозом, поскольку ее ингибитор никак не влиял на его эффекты. Ингибитор JNK также не оказывал влияния и на ингибирование экспрессии антиапоптотического фактора BCL2A1соединением I и прогестероном. В этом году завершена работа по изучению действия прогестерона и селективных лигандов mPRs на мРНК ряда цитокинов и секрецию белков IL-1beta, IL-6, IL-10 и TNFalpha мононуклеарными клетками периферической крови мужчин и женщин. Экспрессия генов этих цитокинов исследована также в моноцитах клеточной линии ТНР-1, в лимфобластах К562, а ранее – в Т лимфоцитах Jurkat. Новые селективные лиганды mPRs действовали аналогично прогестерону, оказывая такое же иммуномодулирующее действие. На иммунные клетки изучаемые соединения действовали через mPRs и оказывали как провоспалительное, так и противовоспалительное действие в зависимости от фенотипа данной клетки. По результатам этой работы опубликованы тезисы на 43 международном конгрессе FEBS и подготовлена статья. | ||
| 3 | 1 января 2019 г.-15 декабря 2019 г. | Изучение противоопухолевой активности и иммуномодуляторного действия селективных лигандов мембранных рецепторов прогестерона |
| Результаты этапа: Для осуществления синтеза белков разных субтипов мембранных рецепторов в клетках, где никаких рецепторов прогестерона выявлено не было, мы сделали плазмидные векторные конструкции с их генами. Клетками, не содержащими ни мембранных, ни ядерных рецепторов прогестерона, были клетки аденокарциномы простаты человека LNCaP, как было показано в нашей работе. После трансфекции клеток плазмидами с генами рецепторов в клетках LNCaP были обнаружены соответствующие белки, которые предполагалось изучать индивидуально. Рецепторные белки выявлялись с помощью взаимодействующих с ними антител. Мы располагали антителами к С-концевому участку разных субтипов мембранных рецепторов и обнаружили, что интактные клетки не имели сайтов связывания с этими антителами. Но при фиксации клеток агентами, позволяющими антителам проникать внутрь клеток, связывание было обнаружено, то есть рецепторы были выявлены. Это означает, что С-концевой участок мембранных рецепторов находится внутри клетки, о чем до настоящего времени имелись самые противоречивые сведения. Мы надеялись, что искусственно вызванная временная (транзиентная) продукция мембранных рецепторов трех субтипов клетками позволит нам изучить механизм действия каждого индивидуального белка. Работы на транзиентных культурах активно проводятся как в зарубежных исследованиях, так и в нашей лаборатории. Однако при изучении действия прогестерона и селективных лигандов на жизнеспособность клеток LNCaP после трансфекции было обнаружено, что сам этот процесс, помимо продукции рецепторов, вызывал изменение чувствительности мембран и необъяснимые пока артефакты в изменении пролиферативной активности клеток. Поэтому в данном случае оказалось необходимо получение линий клеток, стабильно экспрессирующих изучаемые субтипы мембранных рецепторов. Длительная работа по отбору и культивированию таких клеток после трансфекции на среде с генетицином не позволила к настоящему моменту изучить работу каждого рецептора индивидуально. В нашей работе была изучена продукция девяти наиболее важных цитокинов в разных типах иммунных клеток под действием изучаемых соединений. Исследовалась регуляция уровня мРНК цитокинов, а также секретируемых белков некоторых из них. Селективные лиганды регулировали продукцию цитокинов аналогично прогестерону. Но действие трех стероидов различалось в разных типах иммунных клеток. Эффекты в Т-лимфоцитах были противовоспалительными, но в мононуклеарных клетках периферической крови, в моноцитах и лимфобластах действие было преимущественно провоспалительным. Половых различий в действии гормонов на клетки доноров женского и мужского пола обнаружено не было. Однако наблюдались индивидуальные реакции клеток разных доноров на действие стероидов в отношении продукции интерлейкина 10, интерферона γ, фактора некроза опухолей α, толл-подобного рецептора 4. Из результатов экспериментов следовал вывод, что иммуномодулирующее действие прогестерон и его производные оказывают через мембранные рецепторы. Результаты работы над проектом были опубликованы в статье «Immunomodulatory effects of progesterone and selective ligands of membrane progesterone receptors» в журнале «Steroids», доложены на 44 международном конгрессе FEBS и на международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». По материалам работы защищены кандидатская диссертация, аспирантская квалификационная работа и выпускная дипломная работа магистра. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".