Новые подходы к выделению и групповой идентификации адаптогенов растительного происхождения на основе тандемной хроматомасс-спектрометрии НИР

New approaches for isolation and group identification of herbal adaptogens on the basis of tandem liquid chromatography mass spectrometry

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 20 апреля 2017 г.-15 декабря 2017 г. Новые подходы к выделению и групповой идентификации адаптогенов растительного происхождения на основе тандемной хроматомасс-спектрометрии
Результаты этапа: На примере стероидных спиростаноловых и фуростаноловых сапонинов якорцев стелящихся были исследованы возможности применения нескольких классических техник жидкостной экстракции для извлечения полярных и неполярных компонентов из растительного сырья. Методами однофакторного и двухфакторного эксперимента было изучено влияние таких параметров, как состав и концентрация экстрагента, время экстракции, температура и соотношение фаз, на степень извлечения. При проведении ультразвуковой экстракции наибольшая степень извлечения наблюдалась при использовании изопропанола и ацетонитрила в качестве органических растворителей. Было показано, что степень извлечения протодиосцина и диосцина повышается с увеличением отношения фаз до 100 мл/г и затем практически не изменяется при более высоких отношениях. Следовательно, оптимальное отношение фаз при экстракции - 100 мл/г, т.к. в таком случае необходимо использовать минимальное количество органических растворителей. Для смесей двух выбранных растворителей изопропанола и ацетонитрила с концентрациями от 30% до 100% было установлено, что извлечение протодиосцина и диосцина повышается, при изменении концентрации изопропанола (ацетонитрила) с 30% до 50%. Оптимальная концентрация изопропанола составляет от 50% до 60%, оптимальный диапазон концентраций оказывается более широким (от 50% до 80%) в случае использования ацетонитрила в качестве растворителя. Однако наблюдается снижение эффективности экстракции при повышении концентрации изопропанола с 60%. По достижении концентрации изопропанола и ацетонитрила, равной 50%, степень извлечения была максимальной. Было показано, что степень извлечения значительно увеличивается за первые 60 мин ультразвуковой экстракции. Большая продолжительность экстракции приводит к разложению протодиосцина, поэтому оптимальная длительность экстракции составляет 60 мин. Полнота извлечения была оценена с помощью метода последовательной экстракции. Было установлено, что в выбранных условиях проведения ультразвуковой экстракции на первом акте экстракции извлекается не менее 78% протодиосцина и не менее 64% диосцина от общего содержания аналитов, полученных в ходе 5 актов экстракции. Исследовано влияние органического растворителя на эффективность экстракции в кипящем растворителе (ЭКР) и экстракции в кипящем растворителе при пониженном давлении (ЭКРПН). Изучено влияние органических растворителей (изопропанола и ацетонитрила) в составе экстрагента на степень извлечения протодиосцина и диосцина из T. terrestris. Максимальная степень извлечения протодиосцина наблюдается в 50% растворе изопропанола. Оптимальный диапазон содержаний изопропанола в экстрагенте для извлечения диосцина составляет от 50% до 80%. При проведении экспериментов по изучению влияния состава фаз при экстракции было показано, что в варианте ЭКР отношение фаз, равное 200 мл/г, обеспечивает наибольшее извлечение протодиосцина и диосцина. Проведен двухфакторный эксперимент с целью изучения влияния длительности экстракции и температуры на полноту извлечения протодиосцина и диосцина наиболее перспективными методами экстракции - ЭКР и ЭКРПН. Увеличение времени экстракции для ЭКР с 60 до 240 мин приводит к термическому разложению протодиосцина, и его содержание в экстракте снижается. Аналогично для экстракции в аппарате Сокслета (СЭ) длительная экстракция приводит к разложению протодиосцина при кипячении с обратным холодильником, а оптимальное время экстракции оказалось 12 часов. Из проведенных экспериментов было установлено, что степень извлечения протодиосцина и диосцина методами ЭКР, ЭКРПН и СЭ в выбранных оптимальных условиях экстрагирования была приблизительно в 2 раза выше, чем на первом акте УЗЭ и более чем в 1.2 раза выше, чем общее содержание аналитов, полученных в ходе 5 актов УЗЭ. Изучено хроматографическое разделение и масс-спектрометрическое поведение спиростаноловых и фуростаноловых сапонинов якорцев стелящихся, а также флавоноидных гликозидов шлемника байкальского. Разработан подход для хромато-массспектрометрического определения протодиосцина и диосцина методом ВЭЖХ-МС в растительных экстрактах. Разработан подход для хромато-массспектрометрического определения вогонина, скутелларина, байкалина, байкалеина методом ВЭЖХ-МС в растительных экстрактах. Выявленные зависимости отклика масс-спектрометрического детектора от условий детектирования (потенциала декластеризации, входного потенциала, энергии соударений и др.) для исследуемых соединений и закономерности формирования их масс-спектров будут использованы при формировании массивов спектральных и хроматографический данных для адаптогенов растительного происхождения.
2 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. Новые подходы к выделению и групповой идентификации адаптогенов растительного происхождения на основе тандемной хроматомасс-спектрометрии
Результаты этапа: 1. В ходе проведения экспериментов выбраны условия хроматографического разделения в варианте обращенно-фазовой и гидрофильной хроматографии для сахаридных производных и гликозидов растений, обладающих адаптогенными и тонизирующими свойствами. Найдены условия для селективного разделения сахаров, сахароспиртов и их производных в экстрактах и хвои и установление закономерностей удерживания, которые могут быть в основе конечных стадий разделения для близких по свойствам и отличающихся сахаридной цепочкой биоактивных соединений и других растений. 2. Исследовано влияние условий проведения экстрагирования на степень извлечения целевых компонентов из выбранных образцов растительного сырья. Проведены эксперименты по оптимизации параметров проведения экстракции стероидных сапонинов и клеток растения диоскорея дельтовидная и сахаридных производных из хвойной биомассы с помощью экспериментального дизайна. 3. Разработаны способы количественной оценки содержания целевых компонентов и их аналогов в полученных образцах экстрактов методом ВЭЖХ-МС. Полученные в результате двух лет работы результаты систематизированы и объединены в экспериментальные схемы по выделению и разделению физиологически активных компонентов, обладающих разными химическими свойствами.
3 1 января 2019 г.-15 декабря 2019 г. Новые подходы к выделению и групповой идентификации адаптогенов растительного происхождения на основе тандемной хроматомасс-спектрометрии
Результаты этапа: В ходе исследований в течение 3-го года работы по проекту были исследованы 12 наиболее распространенных видов хвойных пород умеренных широт Евразии. Основными сахарами, в их составе оказались глюкоза, фруктоза, сахароза и раффиноза. Эти вещества были обнаружены в значительных количествах почти у всех исследованных видов растений. На долю главных углеводов приходилось от 97% до 100% от исследованных углеводов. Основную долю (около 91%), обнаруженных адаптогенных сахароспиртов, составляли циклические полиолы - циклитолы (инозитол, секвоитол и пинитол). У растений рода Abies суммарное количество циклитолов в хвое превышало его содержание у других исследованных видов в 4.2 раза. В растениях из этого рода содержание инозитола и пинитола по сравнению с другими исследованными растениями было выше в 9 и в 4 раза, соответственно. Для классификации видов хвойных растений на основании паттерна распределения сахаров и сахароспиртов были применены методы математической статистики, включая линейную регрессию, метод опорных векторов, метод случайного леса. Данные анализа обширного биологического материала, использованного в работе, свидетельствуют о том, что содержание исследованных соединений внутри конкретного вида растения, в пределах естественных ареалов произрастания, не сильно зависит от возраста и природно-климатических факторов. В рамках проведенных исследований были разработаны и апробированы на реальных образцах схемы извлечения и выделения стероидных гликозидов и агликонов тритерпеновых сапонинов женьшеня. Выбраны условия экстракции исследуемых соединений из разных образцов растительных материалов и клеточных культур. Разработаны схемы фракционирования полученных экстрактов методами жидкость-жидкостной экстракции, колоночной хроматографии и твердофазной экстракции. Выбраны условия хроматографического разделения интересующих компонентов, которые могут быть взяты за основу для препаративного выделения отдельных биоактивных соединений в промышленных масштабах. Выделены и охарактеризованы шесть основных компонентов стероидной фракции гликозидов диоскореи дельтовидной. Для их детектирования в смесях применяли ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения. Сформирован банк ВЭЖХ-МС данных об основных и перспективных физиологически активных компонентах (всего около 100) в экстрактах из изученных растений, обладающих адаптогенными, антидепрессивными, антистрессовыми, антиоксидантными и тонизирующими свойствам. В опубликованных обзорных статьях рассмотрены и систематизированы различные варианты хроматомасс-спектрометрического анализа экстрактов из лекарственных растений, а также варианты интегрирования таких высокоинформативных инструментов в исследования по изучению биоактивности этих экстрактов и индивидуальных компонентов, Показаны основные направлении развития метода ВЭЖХ-МС в области анализа растительных материалов, с учетом, как результатов данного проекта, так и существующего мирового опыта, представленного в виде открытых публикаций в ведущих международных журналах. Предложена уникальная система классификации существующих аналитических процедур по типу извлекаемой информации об индивидуальном и структурно-групповом химическом составе натуральных продуктов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".