![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Исследование закономерностей полимеризации циклических оксалатов, синтез блок-полиоксалатов, использование сополимеров для доставки лекарств
Synthesis of biodegradable materials is one of the most sought-after areas of polymer chemistry. The ability to degrade in biological fluids and water is the most important property of carriers for controlled drug delivery, and, as a result, low-toxic and easily excreted products should be formed. Polylactides are widely used in medicine and the food industry. However, they degrade within dozens of days. This project proposes to synthesize polyoxalates, esters of oxalic acid and glycols, which are intermediate products of metabolism. The use of oxalate groups has several advantages. First, oxalic acid is a strong acid with a pKa of about 1.4 when dissociated in the first step. Consequently, hydrolysis of oxalates should proceed dozens of times faster than hydrolysis of polylactides. Secondly, the structure of polyoxalates enables additional "tuning" of the hydrolysis rate by varying pKa and hydrophobicity of the used diols. A wide variety of commercially available diol structures, their relatively low toxicity and the availability of methods for obtaining cyclic oxalates in the literature expand the possibilities of the approach proposed in the present project. Methods for obtaining polyoxalates based on polycondensation of oxalyl chloride or oxalic acid esters with diols have been described in the literature. Despite the simplicity and versatility of this approach, it has several limitations. First, the dispersity of such polymers increases sharply with increasing conversion, which makes it impossible to obtain high-molecular-weight narrowly dispersed polymers with a high degree of polymerization. In addition, in order to obtain block copolymers by polycondensation it is necessary to crosslink already prepared blocks, which cannot be fulfilled with high efficiency. Both of these problems can be solved by cyclic oxalate polymerization due to the chain nature of this process. This strategy is the main one for the synthesis of polylactides, but it has not been studied for the production of polyoxalates. Therefore, this project will focus on the investigation of ring-opening polymerization of cyclic oxalates. In addition to homopolymers, the synthesis of amphiphilic block copolymers containing polyoxalate in the hydrophobic block and polyethylene oxide (PEG) as the hydrophilic block is envisaged. The properties of these copolymers will be compared with copolymers containing a polylactide block. Monomethoxy-polyethylene oxides with one end functional group will be used as macroinitiators to obtain block copolymers. Polymerization of cyclic oxalates is expected to be carried out in the melt and/or in solution by the mechanism of coordination catalysis by tin (II) 2-ethylhexanoate (SnOct2). The regularities of propylene oxalate polymerization (initiation, chain growth, termination and transfer pathways) will be investigated. The aggregation and formation of micelles in aqueous solutions of PEG-poly(propylene oxalate) block copolymers will be compared with the colloidal properties of PEG-poly-D,L-lactide copolymers of similar composition. The shape of the associates will be investigated by electron microscopy and the particle size by dynamic light scattering. The stability of the block copolymers in aqueous solutions will be investigated by dynamic light scattering and gel permeation chromatography. The possibility of loading the obtained micelles with two biologically active substances of different nature will be investigated. The obtained polymeric micelles will be investigated in experiments on cells in culture. The cytotoxicity of PEG-polylactide and PEG-polypropylene oxalate copolymers and their effect on the drug resistance of cancer cells will be determined.
1. Синтез и очистка циклического 1,2-пропиленоксалата. 2. Исследование возможности синтеза полиоксалатов методом металлокомплексной полимеризации, катализируемой октаноатом олова (II) или анионной полимеризации. Характеристика сополимеров. 3. Оптимизация условий полимеризации оксалатов и наработка серии блок-сополимеров пропиленоксалата и ПЭГ, различающихся относительным содержанием полиоксалата. 4. Синтез блок-сополимеров D,L-лактида и ПЭГ состава близкого к серии блок-сополимеров на основе пропиленоксалата. 5. Исследование размеров ассоциатов блок-сополимеров на основе D,L-лактида и пропиленоксалата в водных растворах методом динамического светорассеяния. 6. Сравнительное изучение стабильности блок-сополимеров методом гельпроникающей хроматографии и динамического светорассеяния. 7. Исследование цитотоксичности блок-сополимеров. В случае обнаружения высокой цитотоксичности, может быть оптимизирована методика очистки сополимеров. 8. Синтез БТЭЭ-оксалата. 9. Изучение способов загрузки мицелл блок-сополимеров ПЭГ-полилактид и ПЭГ-поли(1,2-пропиленоксалат) БТЭЭ-оксалатом 10. Публикация статьи по теме проекта
Научный коллектив имеет большой опыт по синтезу низкомолекулярных оксалатов и полиоксалатов. Ранее нами было показано, что полимерные нанореакторы, представляющие собой эмульсию раствора полиоксалата и тетраметилового эфира гематопорфирина (ТМГП) в диметилфталате, стабилизированную плюроником L64, способны не только продуцировать свет, но и синглетный кислород за счет реакции с биогенной перекисью водорода в раковых клетках. Было также показано, что проведение пероксиоксалатной реакции в мицеллах плюроников и сополимера этиленоксида и диметилсилоксана позволяет существенно повысить эффективность пероксиоксалатной реакции за счет замедления гидролиза лабильных ароматических оксалатов. Поиск нетоксичных оксалатов и носителей для доставки оксалатов привел нас к идее синтеза блок-сополимеров тирозина и этиленоксида. Однако попытка получить меж- или внутрицепные оксалатные сшивки в таких мицеллах также не увенчалась успехом вследствие достаточно высокой жесткости полипептидных цепей поли-L-тирозина. Тем не менее, используя полученные сополимеры, мы исследовали закономерности образования частиц различной формы (сферические или стержнеобразные мицеллы, везикулы или полимерные наночастицы) в рядах этих сополимеров. Были также подробно исследованы закономерности восстановления этими частицами золотохлористоводородной кислоты, и свойства образующихся золотых наночастиц в работе. Таким образом, научная группа имеет опыт в области совместных работ по синтезу полиоксалатов методом поликонденсации (д.х.н. Мелик-Нубаров Н.С.), полимеризации с раскрытием цикла, по крайней мере, двух мономеров различной природы (L-тирозин-N-карбоксиангидрида и L-лактида, Якимов Н.П. и Мелик-Нубаров Н.С.), исследования структуры коллоидных частиц блок-сополимеров в водной среде (Якимов Н.П. и Мелик-Нубаров Н.С.), их взаимодействия с клетками в культуре (д.б.н. Гроздова И.Д.) и количественного измерения скорости гидролиза сложных эфиров и полиэфиров в водной среде (Дец Е.А.).
1) Синтезирован циклический пропиленоксалат. Разработаны способы его очистки методом фракционной перегонки в вакууме. 2) Исследованы механизмы превращений макромолекул, происходящие при полимеризации циклического пропиленоксалата в присутствии октаноата олова (II) в качестве катализатора. Изучены особенности полимеризации циклических оксалатов в сравнении с полимеризацией других циклических сложных эфиров. 3) Впервые изучены способы синтеза блок-сополимеров пропиленоксалата и этиленоксида. Изучены методы его фракционирования. 4) Синтезирована линейка блок-сополимеров оптически активного лактида, а также его рацемата с полиэтиленгликолем. 5) Исследована скорость гидролиза блок-сополимеров лактида и полиэтиленгликоля в воде при различных рН потенциометрическим методом. 6) Изучен размер частиц блок-сополимеро лактида и полиоксалата с полиэтиленгликолем 7)Исследована цитотоксичность блок-сополимеров лактида и этиленоксаида по отношению к раковым клеткам. Показано, что блок-сополимеры практически нетоксичны для клеток в культуре. 8) Изучено влияние блок-сополимеров на устойчивость раковых клеток к действию лекарств. 9) Снтезировон ВТЕЕ-оксалат на основе этилового эфира N-бензоил-L-тирозина, продемонстрирована его более низкая токсичность по сравнению с оксалатами на основе синтетических фенолов. 10) Исследованы способы упаковки оксалатов в полимерные мицеллы блок-сополимеров лактида и полиэтиленгликоля.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 16 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Полимеризация циклических оксалатов: синтез и свойства амфифильных блок-полиоксалатов |
Результаты этапа: 1. Синтез и очистка циклического 1,2-пропиленоксалата Циклический пропиленоксалат мы синтезировали, проводя конденсацию пропиленгликоля с оксалилхлоридом в присутствии основания. (Рис. 1 в файле с доп. информацией) Данная реакция сопровождается образованием полимерного полипропиленоксалатакоторый подвергали деполимеризации при 130оС согласно работе [1], отгоняя в вакууме циклический пропиленоксалат при пониженном давлении (около 0,05 Торр). Именно эту процедуру мы и положили в основу методики, использованной наи для получения больших количеств циклического пропиленоксалата. Анализ спектра 1Н-ЯМР синтезированного мономера показал наличие 4 сигналов, соответствующих протонам фрагмента CH3-CH-CH2 (Рис. 2). Дублет в сильном поле при 1,49 м.д. был отнесен к трем эквивалентным атомам Н группы СН3, связанным с метиновой группой. Для диастереомерных метиленовых протонов наблюдаются два дублета в слабом поле при 4.46 и 4.53 м.д. Сигнал атома Н метина при 4.98 м.д. демонстрирует сложное расщепление (дублет квартетов дублетов), обусловленное вицинальным спин-спиновым взаимодействием с атомами водорода метильной и метиленовой групп. В то же время в спектре при значительном усилении можно выделить полосы, смещенные в сильное поле по сравнению с доминирующими полосами. Мы предположили, что они обусловлены наличием примеси гидролизованного мономера (как минимум два неэквивалентных по химическим сдвигам соединения, Рис. 3). Сдвиг сигналов протонов в сильное поле, очевидно, является следствием уменьшения электронной плотности на метиновых группах, вызванного раскрытием цикла вследствие гидролиза. При очистке пропиленоксалата вакуумной перегонкой содержание примесей постепенно уменьшалось (Рис. 4a-c), что в итоге привело к содержанию примесей на уровне около 1%. Такое количество примесей не может быть количественно оценено методом 1H-ЯМР. Полученный мономер был впервые охарактеризован методом дифференциальной сканирующей калориметрии (Рис. 5), которая выявила температуру плавления образца -37,8 оC с энтальпией около 4 Дж/г. 2. Исследование полимеризации 1,2-пропиленоксалата методом металлокомплексной полимеризации, катализируемой октаноатом олова (II) 2.1. Полимеризация в отсутствие добавленного инициатора. Поскольку синтезированный нами циклический пропиленоксалат содержал примесь гидролизованного мономера (монооксалат пропиленгликоля, Рис. 6), который может играть роль инициатора, мы оценили возможность проведения полимеризации в отсутствие дополнительного инициатора. Образцы для полимеризации готовили в атмосфере аргона, подвергая 100 мг мономера трем циклам вакуумирования при остаточном давлении 0.1-0.05 Торр и насыщения аргоном. Далее к образцам добавляли раствор катализатора в очищенном ТГФ, приготовленном в инертной атмосфере. Добавленный растворитель тщательно удаляли в вакууме при 50-60оС и запаивали образцы в вакууме. Образцы полимеризовали в течение суток при 100оС в масляной бане. При изучении этой системы мы сразу же натолкнулись на ряд особенностей, отличающих ее от полимеризации других циклических эфиров оксикарбоновых кислот: (а) образование олигомеров, не превращающихся в полимер при увеличении конверсии, (б) образование осадка, нерастворимого в органических растворителях, и (в) широкое молекулярно-массовое распределение основного полимерного продукта. На данном годичном этапе работы мы попытались изучить механизмы, лежащие в основе этих особенностей, и определить их связь со структурой циклических оксалатов в сравнении с другими циклическими мономерами для синтеза полиэфиров. Исследование реакционной смеси после окончания полимеризации методом эксклюзионной хроматографии показало образование двух фракций, сильно различающихся по молекулярным массам. (Рис. 7а, кривая 1) Одна из них представляет собой линейный полимер, степень полимеризации которого зависит от условий реакции (температура, время полимеризации, концентрация октаноата олова, содержание примесей), а другая фракция представляет собой олигомеры, состоящие из 3-6 звеньев пропиленоксалата (масса пика около 570, независимо от условий эксперимента). Предполагая равенство инкрементов показателей преломления для мономера и полимеров различной степени полимеризации, можно оценить, что суммарная фракция олигомеров и мономера составляет около 17%. В противоположность полимеризации лактида, конверсию которого можно легко определять по данным эксклюзионной хроматографии, делая поправку на различие в инкрементах показателей преломления мономера и полимера, в полимеризации оксалата этот метод дает искаженные результаты. Это вызвано образованием большого количества олигомеров, образующихся в ходе реакции. Перекрывание пиков олигомеров и остаточного мономера существенно искажает эти данные. Для оценки параметров молекулярно-массового распределения полиоксалатов мы описывали низкомолекулярный пик хроматограмм функцией Гаусса и полученную кривую вычитали из экспериментальной кривой. Результат вычитания использовался для оценки моментов молекулярно-массового распределения (Mw, Mn и дисперсии Mw/Mn) (Рис. 8a). Во всех опытах полимеры, синтезированные как в отсутствие, так и в присутствии добавленного инициатора имели широкое молекулярно-массовое распределение с Mn около 10000 и дисперсией 2-2.5. Для препаративного отделения олигомеров от основной полимерной фракции мы использовали метод фракционного осаждения диэтиловым эфиром. При смешивании раствора полимера в тетрагидрофуране 60 мг/мл с равным объёмом диэтилового эфира выпадает практически весь высокомолекулярный продукт, а олигомерная и мономерная фракции остаются в растворе. (Рис. 8b). Хроматограмма очищенного полимера практически полностью совпадала с результатом вычитания гауссовой аппроксимации низкомолекулярного пика. (Рис. 8b), что указывает на удовлетворительную точность вычитания сигнала олигомеров из хроматограмм. Анализ спектров 1Н-ЯМР полимеров (Рис. 9) показал, что основные полосы спектра сдвигаются вследствие раскрытия цикла мономера. Отличие химических сдвигов полос в спектре ЯМР, отвечающих остаточному мономеру и звеньям полимера, дает возможность оценить конверсию мономера с достаточно высокой точностью. Эти оценки показали, что полимеризация в течение суток при 100оС проходит с конверсией около 93.6±1%. Дальнейшее увеличение времени полимеризации до 2 или 3 суток не приводит к увеличению конверсии мономера, т.е. данное значение является равновесным. Оценка кинетических параметров полимеризации пропиленоксалата на данном этапе не входила в наши планы, однако необходимость ее подробного исследования стала очевидна в ходе данного этапа работы. Поэтому на следующем годичном этапе мы подробно исследуем кинетику полимеризации циклического пропиленоксалата в зависимости от концентрации катализатора. 2.2. MALDI-TOF-анализ фракций олигомеров и полимеров Для установления химической структуры концевых групп полученных полимеров использовали MALDI-TOF масс-спектрометрию. В спектрах реакционной смеси, полученных при полимеризации без добавления инициатора (Рис. 10), наблюдались две основные группы сигналов от компонентов, массы которых растут с шагом 130, соответствующим молекулярной массе пропиленоксалата. Первая серия состояла из интенсивных сигналов, соответствующих массам, кратным 130, с остатком 23 (Na+) или 39 (K+). Эти значения масс можно отнести к циклическим молекулам (Рис. 10, тип С). Их интенсивность резко снижалась с ростом степени полимеризации N. Сильное уменьшение концентрации молекул с ростом молекулярной массы указывает на то, что, скорее всего, эти соединения образуют олигомерную фракцию, обнаруживаемую эксклюзионной хроматографией. Механизм их образования показан на Рисунке 11а. В области более высоких молекулярных масс преобладает фракция 130n+76+23(39) линейных молекул с пропиленгликолевыми фрагментами (M = 76) на концах (Рис. 10, тип L). На Рисунке 11b показан предполагаемый механизм их образования за счет асимметрической межмолекулярной переэтерификации. 2.3. Анализ природы кристаллического осадка при полимеризации циклического пропиленоксалата и определение его количества. Как было сказано выше, особенностью полимеризации оксалата пропилена в присутствии Sn(Oct)2 является образование осадка. Он представлял собой белый кристаллический порошок, нерастворимый в органических растворителях, но растворимый в концентрированной HCl. Элементный анализ осадка показал, что его состав близок к составу оксалата олова, SnC2O4: доли H, C и Sn составляли 1,4±0,3, 11±3, 59±3 % (теория: 0, 11,6, 57,4 %). Природа выпадающего в ходе полимеризации белого осадка была также независимо подтверждена методами термогравиметрического анализа и рентгено-фазового анализа (Рис. 12). Количество образовавшегося в ходе полимеризации оксалата олова определяли с помощью иодометрического титрования, которое проверяли с помощью свежесинтезированного в лаборатории оксалата олова (II) (Рис. 13). Можно предположить, по меньшей мере четыре различных пути образования оксалата олова в ходе полимеризации пропиленоксалата в присутствии Sn(Oct)2 (Рис. 14). Однако полностью согласуется со всеми экспериментальными данными лишь механизм (d), предполагающий отщепление оксалатных остатков от конца цепи, сопровождающееся сдваиванием полимерных цепочек. 2.4. Полимеризация в присутствии добавленного инициатора. На следующем этапе мы изучили полимеризацию циклического оксалата в присутствии добавленного инициатора. В качестве инициатора полимеризации с циклических сложных эфиров могут выступать различные спирты, например, бензиловый спирт (BnOH). Этот инициатор может моделировать процессы, которые могут происходить в присутствии полимерного инициатора, например, монометоксиполиэтиленгликоля. Общеизвестно, что при полимеризации с раскрытием цикла в отсутствие посторонних нуклеофилов в системе и побочных процессов, влияющих на среднечисловую молекулярную массу полимера, она должна линейно возрастать с увеличением обратной концентрации инициатора. [2] Для исследования применимости этих закономерностей к полимеризации циклических оксалатов мы изучили зависимость Mn от концентрации бензилового спирта (Bn-OH), используемого в качестве инициатора. Как показано на Рисунке 15, степень полимеризации растет линейно с увеличением соотношения концентрации мономера к концентрации инициатора. Это указывает на возможность регуляции степени полимеризации полиоксалата концентрацией инициатора. По мере понижения концентрации добавленного инициатора молекулярная масса полимера асимптотически приближается к молекулярной массе, получающейстя в отсутствие добавленного инициатора. Анализ концевых групп полимеров, полученных в присутствии бензилового спирта методом масс-спектрометрии MALDI-TOF выявил 6 типов сигналов (Рис. 16а). Они соответствуют структурам, различающимся концевыми группами, которые представлены циклическими олигомерами без концевых групп и линейными макромолекулами, содержащими на каждом конце один из 3 остатков: пропиленгликолевый, бензильный или оксалатный (Рис. 16b). На Рис. 16в показано изменение интенсивности сигнала с увеличением степени полимеризации, N, в диапазоне от 5 до 10 звеньев. Анализ продуктов, полученных в ходе полимеризации, указывает на то, что полимеризация циклических оксалатов, катализируемая октаноатом олова, осложнена процессами переэтерификации, приводящими к уширению молекулярно-массового распределения и переносу концевых групп. В результате этих реакций происходит образование полностью стохастического распределения концевых групп. Можно предположить, что причиной столь значительного вклада процессов переэтерификации является высокая реакционная способность щавелевой кислоты, вызванная соседством двух карбоксильных групп в одной молекуле. Важным следствием данного результата являются существенные ограничения, налагаемые строением полиоксалатов, на возможности синтеза блок-сополимеров с полиоксалатным гидрофобным блоком. Действительно, если бы вместо бензилового спирта использовался бы полимер, содержащий концевую гидроксильную группу, например, монометокси-полиэтиленгликоль, в препарате содержалось бы около 50% двублочного полимера, около 10% трехблочного с двумя цепями ПЭГ по концам и около 40% продукта полимеризации представляло собой гомополимер. В дальнейшем мы покажем, что данные закономерности выполняются и при использовании полиэтиленоксида в качестве инициатора. Таким образом, данный пункт программы исследований, был не только выполнен, но и существенно перевыполнен. Действительно, мы не только показали возможность металлокомплексной полимеризации циклического пропиленоксалата, но и впервые обнаружили существенные особенности полимеризации данного мономера с раскрытием цикла, отличающих пропиленоксалат от других циклических сложных эфиров (лактида, капролактона, карбонатов, валеролактона и др.). Помимо этого, нами были впервые исследованы некоторые детали механизма полимеризации данного типа циклических сложных эфиров. В процессе полимеризации циклических оксалатов образуется достаточно большое количество (около 13%) циклических продуктов, выявляемых MALDI-TOF спектрометрией. Холя циклические продукты отмечались ранее и при полимеризации лактидов и карбонатов, их количество относительно линейного полимера обычно заметно меньше. Полимеризация циклического пропиленоксалата сопровождается выделением осадка оксалата олова. Его количество составляет около 60% от всего добавленного катализатора, поэтому эта реакция незначительно влияет на скорость полимеризации в присутствии избытка катализатора. Однако образование этого побочного продукта, по всей видимости, сопровождается сшиванием полимерных цепей по концам, содержащих оксалатные звенья. Исследование полимеризации в присутствии добавленного инициатора бензилового спирта показало, что полимеризация оксалатов осложняется переэтерификацией с участием свободных концевых групп. Эта переэтерификация, очевидно, катализируется октаноатом олова, поэтому при инициировании полимеризации бензиловым спиртом около половины цепей содержат бензильные остатки на концах цепи. Помимо сополимера, содержащего концевые группы бензилового спирта и пропиленгликоля, около 10% цепей содержат бензильные группы по обоим концам. Хотя переэтерификация сопровождает полимеризацию многих циклических сложных эфиров, ее интенсивность при синтезе циклических оксалатов значительно более выражена. 3. Синтез блок-сополимеров с монометоксиполиэтиленгликолем. Для получения блок-сополимеров в качестве инициатора был взят монометоксиполиэтиленоксид со среднечисловой молекулярной массой около 3.1кДа. При полимеризации мы учитывали, что мономер изначально содержит примесь гидролизованного мономера. Для оценки количества внутреннего инициатора мы использовали данные по предельной степени полимеризации пропиленоксалата в отсутствие добавленного инициатора. Для использованного препарата мономера она составляла 8000 г/моль. Тогда концентрация инициатора в мономере может быть рассчитана из соотношения С(Iint)=q*[M]0/Pn, где q – предельная конверсия мономера, Рn – предельная степень полимеризации полимера, полученного в данных условиях, а M0 – исходная концентрация мономера. Исходя из этого, концентрация внутреннего инициатора составляет примерно 0.15 М, что соответствует 1.3% гидролизованного мономера. Основываясь на этих данных, мы добавляли внешний инициатор ПЭГ5000 в концентрации, сопоставимой (образец №56, 30.8 мг мПЭГ+ 59.5 мг пропиленоксалата) и в три раза превышающей (№57, 58.4 мг пПЭГ + 31.9 мг пропиленоксалата) концентрацию внутреннего инициатора. После проведения полимеризации и отделения выпавшего оксалата олова мы исследовали получившиеся сополимеры с помощью ГПХ. (Рис. 17а) Оказалось, что в образце №56 среднечисловая молекулярная масса увеличилась до 4500 г/моль, а в случае большего избытка пропиленоксалата – до 5000 г/моль. Это соответствовало средней степени полимеризации полиоксалатного блока 12 и 15, соответственно. Дисперсности полученных препаратов были достаточно велики и составляли, соответственно, 1.7 и 1.62, что говорило о чрезвычайно широком молекулярно-массовом распределении данных образцов. Данные, полученные нами с использованием в качестве внешнего инициатора бензилового спирта, свидетельствуют о протекании переэтерификации с образованием гомополимера и трехблочных сополимеров, содержащих на обоих концах цепи две группы внешнего инициатора. Поскольку метод масс-спектрометрии, примененный нами для анализа гомополимеров с бензильными группами на концах цепи, затруднительно использовать для анализа блок-сополимеров, для анализа их однородности мы исследовали полученные препараты методом турбидиметрического титрования. Для получения блок-сополимеров мы предприняли попытку провести препаративное выделение блок-сополимера. Для этого к 50 мг сополимера №57 в 10 мл ТГФ было добавлено 0.26 объемных долей DBE и раствор был отцентрифугирован при 6000хg для отделения выпавшего гомополимера. Надосадочную жидкость и осадок высушили от DBE и проанализирволали с помощью эксклюзионной хроатографии. Оказалось, что оба образца содержали как гомополимер, так блок-сополимеры, т.е. фракционное осаждение не позволило очистить блок-сополимер от примеси гомополимера. (Рис. 17b) Очевидно, что неудача в синтезе блок-сополимеров связана с не только с высокой скоростью переэтерификации, но в основном, с наличием примерсей гидролизованного оксалата в составе циклического мономера. Столкнувшись с этой проблемой, мы поставили задачу очистить исходный мономер от примеси гидролизованного оксалата. Как показано выше, (Рис. 4) повторные перегонки не позволяют снизить содержание примесей до уровня менее 0.8%. Поэтому мы исследовали возможность удаления следов нуклеофилов из препарата мономера с помощью их модификации электрофильными реагентами. На первом этапе мы исследовали возможность решения этой проблемы с помощью бензоилхлорида, полагая, что данный хлорангидрид будет эффективно взаимодействовать с гидроксильными группами, и впоследствии нам удастся удалить его избыток и продукты его взаимодействия с гидролизованным мономером при перегонке. Оказалось, что, данную реакцию необходимо проводить в присутствии основания (пиридин или карбонат калия), добавление которых приводит к дополнительному гидролизу мономера, т.е. в результате такого воздействия качество мономера ухудшалось. Анализ литературы по реакциям гидроксильных групп с различными электрофилами натолкнул нас на мысль об использовании изоцианатов. Реакция изоцианатов со спиртами является реакцией присоединения, т.е. она не сопровождается выделением кислот. При этом данная реакция не требует добавления никаких дополнительных реагентов в препарат мономера. Мы предположили, что было бы удобно присоединить изоцианатные группы к твердому носителю и попытаться экстрагировать нуклеофильные примеси из мономера. Для этого мы использовали силикагель с присоединенными аминогруппами (Диасорб-амин, Биохиммак-СТ). Носитель модифицировали большим избытком толуол-диизоцианата, отмывали носитель от избытка диизоцианата тщательно обезвоженным хлористым метиленом (1.5 л на 20 г носителя) и опреляли емкость носителя с помощью реакции с цианобифенилом, содержащим гидрокси-нонильный заместитель. Оказалось, что, несмотря на то, что толуол-диизоцианат проявлялся в ИК-спектрах модифицированного носителя, ковалентное присоединение индикатора происходило с эффективностью, не превышающей 10% от содержащихся на носителе изоцианатных групп. Анализ литературы по кинетике реакций между изоцианатами и спиртами показал, что данная реакция эффективно протекает лишь в концентрированных растворах, а при миллимолярной концентрации реагентов реакция протекает очень медленно. Поскольку присоединение активных групп на твердый сорбент равносильно минимум 10-кратному разбавлению системы, данный подход пришлось признать нереальным для препаративного отделения мономера от небольших количеств примесей. Более высокая концентрация реагентов достижима при добавлении изоцианатов напрямую в неразбавленный мономер с последующей перегонкой. Для реализации этого подхода мы добавили к мономеру 10% (мол. избыток) бутилизоцианата и выдерживали реакционную смесь при 70оС в течение суток. Оказалось, что после перегонки этого мономера и его полимеризации в стандартных условиях (Sn(Oct)2/M0=1:100, 100оС, 24 час) среднечисловая молекулярная масса возросла в 1.5 раза (от 8кДа до 13 кДа). Данный результат указывает на принципиальную применимость данного подхода, однако очевидно, что он требует дальнейшей отработки. Таким образом, на данном годичном этапе нам не удалось получить свободные от гомополимеров препараты блок-сополимеров пропиленоксалата и ПЭГ, однако подробное исследование механизма реакции и отработка методик очистки мономера дает надежду, что за следующий годичный этап нам удастся получить блок-сополимеры и исследовать свойства их мицелл в водных растворах. 4. Синтез блок-сополимеров D,L-лактида и L-лактида и полиэтиленгликоля различных составов. В отчетный период были синтезированы две серии блок-сополимеров PLA-mPEG, различающихся оптической чистотой мономерного лактида. Для синтеза обоих серий был использован монометоксиполиэтиленгликоль со средней степенью полимеризации 87. Лактид непосредственно перед полимеризацией очищали сублимацией и хранили в эксикаторе над щелочью, а монометоксиполиэтиленгликоль осушали азеотропной отгонкой с безводным бензолом. Полимеризацию лактида под действием Sn(Oct)2 проводили в инертной атмосфере, удаляя следы кислорода и воды из препарата лактида в глубоком вакууме при температуре выше температуры плавления мономера, (130оС для L-лактида и 160 оС - для рацемата Степень полимеризации лактидного блока варьировала от 5-10 до 60-80, а полиэтиленоксидный блок состоял из около 90 звеньев. Молекулярно-массовые характеристики блок-сополимеров и их состав показаны в Таблице 1. Валовый состав блок-сополимеров определяли с помощью 1H-ЯМР спектроскопии. ЯМР спектры, соответствующие сополимеру PLLA36-mPEG87 и L-лактида, приведены на Рис. 18. На спектрах видно, что в результате полимеризации сигнал метинового протона во фрагменте молочной кислоты сдвигается в слабое поле (5.06 → 5.16 м. д.), а сигнал метиловых протонов сдвигается в сильное поле (1.66 → 1.58 м. д.), что согласуется с данными литературы [3, 4]. Кроме того, на спектре появляются сигналы, соответствующие протонам полиэтиленгликоля (3.38 м. д. и 3.64 м. д.). Из соотношения интегралов протонов разных блоков, зная молекулярную массу mPEG, можно определить среднечисловую молекулярную массу сополимеров (Таблица 1 в файле с дополнительной информацией), считая, что распределение образцов по массам унимодальное. Анализ молекулярно-массового распределения блок-сополимеров (Рис. 19) показал, что среднечисловая молекулярная масса блок-сополимеров увеличивалась с увеличением содержания лактида в полимеризационной смеси. При этом величина дисперсности полимеров варьировала между 1.4 до 1.8, указывая на то, что в процессе полимеризации, помимо блок-сополимера, может образоваться также и гомополимер, что может быть вызвано недостаточным высушивание полиэтиленоксида. В то же время, анализ хроматограмм не выявил присутствия существенных количеств гомополимера, что дает озможность не учитывать эту возможность в дальнейшей работе. Данные сополимеры были использованы далее для изучения свойств мицелл блок-сополимеров, исследования их цитотоксичности и упаковки в них гидрофобных оксалатов. 5. Сравнение размеров мицелл PDLLA-mPEG и PLLA-mPEG Водные дисперсии блок-сополимеров готовили методом нанопреципитации полимера разбавлением его концентрированного раствора в ТГФ водой при интенсивном перемешивании. Концентрация ТГФ в конечном растворе сополимеров не превышала 10%. Размеры мицелл блок-сополимеров полиэтиленгликоля, содержащих в качестве гидрофобного блока полилактид и полипропиленоксалат, исследовали методом динамического светорассеяния при концентрации полимеров от 0.7 до 7 мг/мл. Оказалось, что для всех сополимеров, содержащих в гидрофобном блоке полилактид, наблюдалось бимодальное распределение по размерам, причем быстрая мода отвечала частицам со средним гидродинамическим диаметром около 30 нм, а медленная мода отвечала на порядок более крупным частицам (Рис. 20). Содержание крупных частиц в полимерных дисперсиях не превышало нескольких процентов по объему. Размеры мицелл блок-сополимеров на основе оптически чистого L-лактида и его рацемата были близки. При этом с размер частиц слабо менялся с увеличением массовой доли полилактида в составе сополимера. Полученные результаты хорошо согласуются ранее опубликованными данными об образовании агрегатов мицелл блок-сополимеров лактида и этиленгликоля в разбавленных водных дисперсиях. Блок-сополимеры пропиленоксалата и этиленгликоля образовали значительно более крупные частицы, что указывает на наличие в их составе гомополимера. На следующем годичном этапе работы этот же подход будет использован для более подробного исследования размеров мицелл блок-сополимеров пропиленоксалата и этиленгликоля. 6. Исследование гидролитической стабильности амфифильных блок-сополимров ПЭГ и молочной кислоты Поскольку за истекший годичный этап нам не удалось наработать большие количества блок-сополимеров пропиленоксалата и этиленоксида, мы исследовали стабильность блок-сополимеров лактида и этиленоксида в водной дисперсии и сравнили полученные константы скорости с известными из литературы данными о скорости гидролиза полилактида в массе [5]. Согласно этим данным, скорость гидролиза гомополимера полилактида, определяемая по снижению молекулярной массы полимера (изначально, 10000 г/моль), взятого в виде твердой пленки, составляет 5 г/моль/день, что соответствует константе скорости гидролиза около 0.35×10-6 мин-1 при рН 7.4. Это соответствует снижению молекулярной массы в е раз за 5.5 лет. За гидролизом полилактидного блока следили с помощью рН-стата. Прибор автоматически поддерживает рН раствора в ячейке добавлением щелочи, а скорость гидролиза определяется по скорости добавления титрованного раствора NaOH (Рис. 21а). Оказалось, что константа скорости гидролиза полилактида уменьшается с понижением рН и по порядку величины близка к константе скрости гомополимера лактида в пленке. Наблюдаемые различия (гидролиз блок-сополимера в водной дисперсии примерно в 5 раз быстрее, чем гидролиз гомополимера в пленке), по всей видимости, вызваны снятием диффузионных ограничений при переходе от гетерогенной к микрогетерогенной системе. Таким образом за отчетный период в научном коллективе был налажен способ слежения за скоростью гидролиза имфифильных блок-полиэфиров и получены данные оскорости гидролиза амфифильных блок-сополимеров лактида и этиленоксида. Полученные данные о скорости гидролиза рацемического лактида и ПЭГ близки по порядку величины к данным о скорости гидролиза полилактидной пленки при данном рН. 7. Цитотоксичность блок-сополимеров лактида и этиленоксида Цитотоксичность исследовали на клетках аденокарциномы молочной железы человека, проявляющих устойчивость ко многим лекарствам и трудно поддающихся лечению. Для этой линии клеток характерен измененный метаболизм АФК, связанный с устойчивостью этих клеток к большинству химиотерапевтических лекарств []. Поскольку цель данной части проекта состоит в проведении пероксиоксалатной реакции в живых клетках, необходимо было использовать полимеры компоненты этой реакции в нетоксичной концентрации. Поэтому мы исследовали цитотоксичность блок-сополимеров лактида и этиленоксида. Все опыты по цитотоксичности ставили однотипно: исследуемый образец растворяли в ТГФ, добавляли бессывороточную культуральную среду, перемешивали и последовательные двукратные разведения образца в культуральной среде добавляли к клеткам. Максимальная нетоксичная концентрация тетрагидрофурана была исследована отдельно и составила 3.4% (об.). (Рис. 22) Анализ цитотоксичности трех блок-сополимеров на основе D,L-лактида разного состава показал, что IC50 блок-сополимеров, содержавших 5 (PDLLA5-mPEG87), 18 (PDLLA18-mPEG87) и 28 (PDLLA28-mPEG87) звена D,L- лактида составляла в среднем (4.6±0.17) мг/мл (Рис. 23). Сходные результаты были получены и для оптически активных блок-сополимеров PLLA-PEG (Рис. 24). Таким образом мы не обнаружили собственной цитотоксичности блок-сополимеров лактида и этиленгликоля. 8. Влияние блок-сополимеров лактида и этиленоксида на устойчивость раковых клеток к действию противоопухолевого антибиотика доксорубицина Известно, что некоторые амфифильные блок-сополимеры способны подавлять активность мембранных белков, в частности, транспортеров, обусловливающих выброс лекарств из раковых клеток. Более 20 лет назад мы показали, что наибольшей активностью в этом отношении обладают сополимеры, имеющие в качестве гидрофобного блока полимерные простые эфиры - полипропиленоксид [7] или полидиметилсилоксан [8]. Способность полимерных сложных эфиров ранее почти не исследовалась. Между тем, существенным преимущество сложных полиэфиров перед простыми является их способность гидролизоваться под действием эстераз сыворотки крови, а также ферментами лизосом раковых клеток. Поскольку на данногм годичном этапе нам не удалось получить чистые блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксалата, было принято решение перенести некоторые планируемые на второй годичный этап работы выполнить в текущем году. Поэтому на текущем годичном этапе мы исследовали способность блок-сополимеров лактида и этиленоксида влиять на цитотоксичность доксорубицина по отношению к раковым клеткам NCI/ADR-RES. Все блок-сополимеры добавляли к клеткам в заведомо нетоксичной концентрации 0.5 мг/мл. Оказалось, что блок-сополимеры, содержащие короткие полилактидные блоки практически не влияли на цитотоксичность доксорубицина (Рис. 25, кривые 1-3). Однако блок-сополимер, содержащий 61 звено молочной кислоты, уменьшал цитотоксическую концентрацию доксорубицина более, чем на порядок. Это означает, что данный сополимер, блокировал активность мембранного насоса в этих клетках. На следующем годичном этапе данные исследования будут продолжены, учитывая большую практическую и фундаментальную значимость этого результата. 9. Синтез бис-(N-бензоил-L-тирозин этиловый эфир)оксалата и исследование его свойств. Блок-сополимеры пропиленоксалата и этиленгликоля являются перспективными носителями для ароматических оксалатов, которые востребованных в хемоиндуцированной фотодинамической терапии. Однако оксалаты могут проявлять собственную токсичность. В настоящей работе мы предлагаем в качестве такого малотоксичного производного тирозина N-бензоил-L-тирозин этиловый эфир (BTEE), который сшивали оксалилхлоридом в смеси ТГФ/пиридин (Рис. 26a). Чтобы избежать образования моноэфира щавелевой кислоты, оксалилхлооид добавляли маленькими порциями к избытку ВТЕЕ. В процессе выделения и очистки ВТЕЕ-оксалата мы избегали хроматографии, поскольку силикагель или вода способствуют быстрому гидролизу оксалатов.[9] Продукт сшивания анализировали 1H-ЯМР спектроскопией. Сигнал при 6.53 м.д., соответствующий фенольному гидроксилу в исходном BTEE (Рис. 26b), исчезает в спектре оксалата, что указывает на количественное образование оксалата и отсутствие примеси моноэфира щавелевой кислоты в препарате. (Рис. 26c). Чтобы оценить его применимость для биологических экспериментов на клетках в культуре, мы сравнили цитотоксичность BTEE-ox и коммерчески доступного бис(2,4,5-трихлоро-6-(пентилоксикарбонил) фенил оксалата (CPPO). Для этого BTEE-ox и CPPO были солюбилизованы в мицеллах PLLA61-mPEG87 и исследованы на клетках рака яичников NCI-ADR/RES. В отсутствие оксалатов мицеллы PLLA61-mPEG87 не были токсичны для клеток до 2,2 мг/мл (Рис. 28, кривая 1). Их цитотоксичность значительно возрастала при загрузке оксалатами (Рис. 28, кривые 2 и 3). Количество выживших клеток снижалось до 50% (IC50) после инкубации с 0,055 ± 0,005 мМ CPPO (Рис. 28, кривая 3). Для получения такого же эффекта требовалась в 3 раза большая концентрация BTEE-ox (IC50 = 0,155 ± 0,032 мМ). Это означает, что BTEE-ox на основе природной аминокислоты L-тирозина был в 3 раза менее токсичен, чем CPPO для клеток в культуре. 10. Загрузка ВТЕЕ-оксалата в мицеллы блок-сополимера лактида и этиленоксида. Ранее мы показали, что помещение оксалатов в мицеллы плюроника и сополимеров диметилсилоксана и полиэтиленгликоля (ПЭГ) может значительно замедлить гидролиз и тем самым повысить эффективность хемилюминесценции. В настоящей работе мы использовали аналогичный подход, поместив BTEE-ox в мицеллы блок-сополимеров полиэтиленоксида и поли(L-молочной кислоты) (PLLA-PEG) для защиты оксалата от гидролиза. Гидрофобное ядро таких мицелл гораздо менее гидратировано, чем у плюроников, и имеет кристаллическую структуру, что может дополнительно способствовать защите BTEE-оксалата и повышении эффективности пероксиоксалатной хемилюминесцентной реакции (Рис. 28). При растворении блок-сополимера PLLA61-PEG87 в ТГФ и впрыскивании его в большой объем водного буфера (10 мM Na2HPO4, 150 мM NaCl, pH 7.4) образовывались мицеллы со средним гидродинамическим диаметром 35 15 nm. Для того, чтобы ввести компоненты ПО-реакции в эти мицеллы оксалат и перилен прибавляли к раствору полимера в ТГФ и смесь впрыскивали в водный буфер. Излучение света за счёт ПО-реакции регистрировали после впрыскивания пероксида водорода в водном буфере. Оказалось, что введение BTEE-ox в мицеллы блок-сополимера PLLA-PEG приводило к длительному излучению света за счёт ПО-реакции между ВТЕЕ-оксалатом и Н2О2 в мицеллах блок-сополимеров (Рис. 29, сравните кривые 1 и 2). Таким образом, новый субстрат ПО-реакции, синтезированный на основе природной аминокислоты L-тирозина, оказывается менее токсичным для клеток в культуре, чем коммерчески доступный СРРО, полученный из синтетического фенола. 1. Iida T. et al. 1993, 49(46), 10511-10530. 2. Slomkowski S. et al. Polylactides—an overview. Polym. Adv. Technol. 2014, 25 436–447. 3. Kricheldorf H.R. et al. Macromolecules 1988, 21, 2, 286–293. 4. Sedush N.G. et al.. Polym. Sci. Ser. B. 2014, 56, 35–40. 5. Tsuji H. et al.Biomaterials 25 (2004) 5449–5455. 6. Osbild S.et al. Anticancer Res. 2006. 26. 5 A. 3595–3600. 7. Demina T.V. et al. Biomacromolecules 2014, 15, 7, 2672-2681 8. Pavlov, D.N. et al. Polym. Sci. Ser. A 51, 295–301 (2009). 9. Itaya, T. et al. Chem. Pharm. Bull., 2002, 50, 346. | ||
2 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Полимеризация циклических оксалатов: синтез и свойства амфифильных блок-полиоксалатов |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".