| Результаты этапа: В соответствии с задачами проекта получены следующие методические и научные результаты:
Методом измерения трансэндотелиального электрического сопротивления исследован и охарактеризован количественно доз-зависимый эффект аденозина (1-100 mМ) как агента, усиливающего барьерные свойства эндотелиального монослоя в норме и защищающего эндотелиальный барьер при действии веществ, вызывающих барьерную дисфункцию (тромбин и нокодазол). Методом прижизненного наблюдения количественно охарактеризован защитный эффект аденозина на поведение ламеллы эндотелиоцитов in vitro. Методом иммунофлуоресцентного анализа изучено действие аденозина на организацию VE-кадгериновых контактов и систему микротрубочек. Вызванное аденозином усиление эндотелиального барьера сопровождается повышением количества VE-кадгерина на поверхности клеток и изменянием морфологии межклеточных VE-кадгериновых контактов, а также реорганизацией системы микротрубочек эндотелиоцитов – во внутренней цитоплазме повышается количество как стабильных, так и динамичных микротрубочек, а на периферии клетки растет количество концов динамичных микротрубочек. Методом количественной оценки содержания белков в примембранном слое эндотелиоцитов показано, что по мере воздействия аденозина помимо постепенного увеличения количества актина наблюдается увеличение количества тирозилированного тубулина, тогда как количество ацетилированного тубулина не меняется. Таким образом, в результате воздействия аденозина резко возрастает количество плюс-концов именно динамичных (но не стабильных) микротрубочек в районе VE-кадгериновых контактов эндотелиоцитов. Полученные результаты подтверждают гипотезу, проверяемую в рамках выполнения настоящего проекта - концы динамичных микротрубочек являются инструментом регуляции эндотелиальной проницаемости и в ситуации, противоположной развитию барьерной дисфункции – в процессе укрепления эндотелиального барьера. Вызванное аденозином усиление барьерных свойств эндотелия зависит от присутствия плюс-концевого белка микротрубочек CLASP1, который является фактором, заякоривающим микротрубочки
в области клеточной мембраны. Методом иммунофлуоресцентного анализа изучено влияния TIP-пептида (вещества-протектора барьерной функции эндотелия, имеющего отличный от аденозина механизм действия) на организацию VE-кадгериновых контактов и цитоскелета эндотелиоцитов. Воздействие TIP-пептида приводит к значительному увеличению толщины и плотности VE-кадгериновых контактов, а также к увеличению количества динамичных, но не стабильных микротрубочек в зоне, непосредственно прилегающей к межклеточным контактам. По-видимому, протекторный эффект TIP-пептида также связан с его способностью изменять динамические свойства микротрубочек. Исследованы различия в динамических характеристиках микротрубочек, полимеризующихся в эндотелиальных клетках человека в ходе воздействия аденозина, а также при последовательном воздействии нокодазола и аденозина. На основе анализа цейтраферной записи поведения плюс-концов индивидуальных микротрубочек описана их динамика в цитоплазме эндотелиоцитов, экспрессирующих EB3-GFP - белок, который связывается с плюс- концами микротрубочек. Результаты сравнительного анализа показывают, что аденозин восстанавливает до нормы динамические характеристики микротрубочек, изменившиеся под воздействием нокодазола. Таким образом, выдвинутая нами гипотеза о том, что аденозин изменяет динамические свойства микротрубочек, получила экспериментальное подтверждение. |
