ИСТИНА

Растения в ответ на вторжение вирусов и бактерий синтезируют макромолекулы (РНК и белки), транспортируемые в различные ткани и органы растений. Существует три уровня движения макромолекул по растению: (а) ядерно-цитоплазматический транспорт, включающий перемещение РНК из ядра в цитоплазму и движение белков, синтезированных в цитоплазме, в ядро на постоянное местопребывание; (б) межклеточное перемещение РНК и белка (ближний транспорт); и (в) дальний транспорт белков и РНК, в том числе и вирусные нуклеопротеиды, по сосудистой системе растения. Вирусы и бактерии различным образом эксплуатируют эти три уровня транспорта. Вирусы растений, большая часть из которых цитоплазматические РНК-содержащие вирусы, активно используют ближний и дальний транспорт для переноса генетического материала по растению. Бактерии как внеклеточные патогены не нуждаются в транспорте генетического материала по растению, однако при колонизации используют ядерно-цитоплазматический транспорт, вводя белковые факторы вирулентности в хозяйское ядро для его «переформатирования». Актуальность исследования роли транспорта макромолекул в иммунитете растений определяется не только фундаментальными интересами познания переноса генетической информации в растении, но и прикладными интересами защиты растений. Наши предварительные результаты свидетельствуют о конкурентных взаимоотношениях между макромолекулами хозяина и патогена на уровне транспорта. Целью данного проекта является выявление молекулярных механизмов транспорта макромолекул растения-хозяина и связь этого процесса с транспортом факторов вирулентности бактерий и вирусов.

1. Создана модель импорта в ядро растительной клетки факторов вирулентности бактерий, основанная на механизме конкуренции макромолекул хозяина и патогена на уровне ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта за общие рецепторы или белки переносчики. Модель описывает взаимодействие клеточного белка NCAPP (non-cell-autonomous pathway protein) с транспортным белком (ТБ) вируса табачной мозаики (ВТМ) и NLS (nuclear localization signal)-содержащими белками бактерий. NCAPP переносит ТБ ВТМ и NLS-содержащие белки к плазмодесмам, где происходит инактивация этих факторов патогенеза. Экспериментальное подтверждение этой модели приведено в докторской диссертации Т.В.Комаровой «Исследование роли транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений и создание биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков» успешно защищенной 28 марта 2013 года на совете Д 501.001.76 биологического факультета МГУ. 2. Идентифицированы клеточные белки и кодирующие их мРНК, синтез которых провоцируется введением в ядро факторов вирулентности бактерий. Мы обнаружили, что такими белками являются пектинметилэстераза (ПМЭ) и NCAPP. Нами показано, что ПМЭ и NCAPP вызывают нарушение импорта ядерных NLS -содержащих белков. 3. Создана модель контролируемого межклеточного транспорта макромолекул в листьях растений с использованием технологии нокаута клеточных генов, ответственных за межклеточный транспорт макромолекул (РНК и белка). Нами получены трансгенные растения Nicotiana benthamiana, в которых экспрессия гена NCAPP подавлена с помощью механизма сайленсинга, что позволяет исследовать роль NCAPP в межклеточном транспорте. Нами предложена модель, согласно которой NCAPP выполняет функцию белка-переносчика, выводящего белковые факторы вирулентности бактерий и ВТМ за пределы первично-инфицированной клетки. 4. Для решения задачи по исследованию молекулярных механизмов функционирования ранее идентифицированных нами метанол-индуцируемых генов (МИГов) мы оптимизировали подход для изучения белок-белковых взаимодействий, подразумевающий использование лиганд-блоттинга и FLAG-системы. Впервые показано прямое взаимодействие ТБ ВТМ и NCAPP in vitro, что подтверждает нашу модель, согласно которой NCAPP выполняет функцию белка-переносчика, выводящего белковые факторы вирулентности бактерий и ВТМ за пределы первично-инфицированной клетки. 5. Исследованы молекулярные механизмы участия межклеточного транспорта макромолекул в антибактериальной защите растений. 5.1. Нами разработана экспериментальная модель изучения природного антибактериального и антивирусного иммунитета незрелых листьев растений. Процесс роста и развития листьев сопровождается изменением межклеточного транспорта макромолекул при участии фермента ПМЭ, деметилирующего пектин клеточной стенки с образованием метанола в качестве продукта реакции. При изучении роли метанола в функционировании плазмодесм мы обнаружили повышенный уровень мРНК ПМЭ и увеличенную концентрацию метанола в соке незрелых листьев табака. С помощью метода супрессионной вычитающей гибридизации мы идентифицировали ряд генов, активность которых изменяется в процессе роста листьев. Среди них оказались гены, чувствительные к метанолу. На основании полученных результатов мы сделали заключение об участии метанола в иммунитете и развитии листьев растений. 5.2. Нами получены экспериментальные свидетельства в пользу разработанной нами концепции участия метанола, ПМЭ и NCAPP в регуляции процессов, связанных с обеспечением иммунитета растений. Согласно этой модели повреждение листьев растения и атака патогенов приводит к циклическим событиям: (а) повышение уровня экспрессии ПМЭ и эмиссии газообразного метанола; (б) испускаемый растением метанол вызывает индукцию ряда генов (МИГов) в листьях того же и соседних растений; (в) повышение экспрессии МИГов приводит к возникновению антибактериальной устойчивости; (г) цикл заканчивается тем, что повышенный синтез NCAPP в качестве одного из МИГов подавляет образование ферментативно-активного ПМЭ и, следовательно, приводит к снижению эмиссии метанола, т.е. система возвращается в исходное состояние. Нами получено экспериментальное свидетельство в пользу существования стадии «г». Установлено, что NCAPP выступает в качестве конкурентного ингибитора формирования зрелого ферментативно-активного ПМЭ. Повышенный синтез в клетке NCAPP подавляет появление в клеточной стенке зрелой ПМЭ. И, наоборот, снижение уровня синтеза NCAPP в клетке приводит к повышенному накоплению ПМЭ в клеточной стенке и более интенсивной эмиссии метанола.