В связи с техническими работами в центре обработки данных, возможность загрузки и скачивания файлов временно недоступна.
 

Разработка биокаталитических стадий получения полидепсипептидов – биодеградируемых полимеров на основе амино- и оксикислотНИР

Development of the biocatalytic stages in the production of polydepsipeptides - biodegradable polymers based on amino- and oxyacids

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 24 апреля 2017 г.-15 декабря 2017 г. Разработка биокаталитических стадий получения полидепсипептидов – биодеградируемых полимеров на основе амино- и оксикислот
Результаты этапа: Изучены возможности ферментативного синтеза мономеров для получения полидепсипептидов – биоразлагаемых полимеров для медицины и других областей применения на основе производных N-альфа-оксиацил-альфа-аминокислот. Впервые разработан хемоэнзиматический метод стереоселективного синтеза замещенных 2,5-дикетоморфолинов, позволяющий увеличить выход конечного продукта, а также исключить использование токсичных галогенангидридов и органических растворителей при использовании биокаталитической стадии. Проведено детальное исследование кинетики биокаталитической стадии ацильного переноса, изучена специфичность ферментов к нуклеофилам и к ацильным донорам, показано, что пенициллинацилазы в реакциях ацильного переноса обладают более высокой стереоспецифичностью по отношению к нуклеофилу, чем по отношению к ацильному донору. Благодаря высокой стереоселективности фермента к нуклеофилу, эффективный препаративный синтез (S)- и (R)-манделильных производных L-альфа-аминокислот может быть проведен с использованием рацемических альфа-аминокислот. Выявлены оптимальные условия для проведения препаративного ферментативного синтеза производных N-альфа-оксиацил-альфа-аминокислот. Исследована зависимость стереоспецифичности фермента и его синтетической активности (эффективности ацильного переноса) от строения используемого ацильного донора, стабильность ферментов в условиях ферментативного синтеза, влияние высоких концентраций исходных веществ и продуктов реакции на инактивацию ферментов. Оценена эффективность препаратов пенициллинацилазы дикого типа в реакциях ацильного перенос. Показано, что пенициллинацилаза из Escherichia coli, в отличие от гомологичного фермента из Alcaligenes faecalis, малопригодна для проведения ферментативного синтеза из-за низкой стабильности в условиях щелочной среды, необходимых для проявления реакционной способности нуклеофила. Обнаружено, что наиболее эффективным катализатором реакции ацильного переноса остатка (S)-миндальной кислоты на нуклеофил является пенициллинацилаза из Alcaligenes faecalis, в то время как ацильный перенос остатка (R)-миндальной кислоты более эффективно катализирует мутантная форма betaD484N пенициллинацилазы из Escherichia coli, обладающая высокой стабильностью в щелочной среде и устойчивая к инактивирующему действию высоких концентраций субстратов. Исследовано превращение N-альфа-оксиацил-альфа-аминокислот в соответствующие 2,5-дикетоморфолины в результате циклизации (внутримолекулярной этерификации) с целью получения мономеров для последующей биокаталитической полимеризации. Проведен препаративный синтез мономеров, разработаны методы выделения, очистки и характеристики целевых продуктов. Сочетание биокаталитических и химических стадий позволило достичь высокого общего выхода замещенных 2,5-дикетоморфолинов (81-93% в пересчёте на L-энантиомер в исходном препарате аминокислоты). Исследованы возможности расширения круга получаемых продуктов при помощи разрабатываемого метода, в первую очередь за счет разнообразия вовлекаемых ацильных доноров. Показано, что пенициллинацилазы способны катализировать эффективный ацильный перенос остатков хлор-, бром- и йодуксусной кислот на альфа-аминокислоты, и это позволяет получать предшественники для синтеза новых замещенных 2,5-дикетоморфолинов после замещения атома галогена на гидроксильную группу в продукте ацильного переноса.
2 8 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. Разработка биокаталитических стадий получения полидепсипептидов – биодеградируемых полимеров на основе амино- и оксикислот
Результаты этапа: По методикам, разработанным за первый год выполнения Проекта и впервые включающим биокаталитическую стадию, синтезирован ряд новых соединений-мономеров, которые были использованы для биокаталитического получения биоразлагаемых полиэфирамидов (полидепсипептидов). Изучена кинетика ферментативного синтеза производного, состоящего из остатков (S)-миндальной кислоты и L-фенилглицина. Выделенный N-(S)-манделил-(S)-фенилглицин подвергали реакции циклизации по разработанной методике. Ряд соединений-мономеров был пополнен производными сложных эфиров N-ацилированных аминокислот. В препаративных количествах были синтезированы этиловые эфиры N-(R)-манделил-(S)-фенилаланина, N-(S)-манделил-(S)-фенилаланина, а также метиловые эфиры N-(R)-манделил-(S)-фенилаланина, N-(S)-манделил-(S)-фенилаланина и N-(S)-манделил-(S)-лейцина, проведён выбор препаратов пенициллинацилазы как катализаторов конкретных стадий синтеза мономеров. Проведено молекулярное моделирование взаимодействия синтезированных соединений-мономеров с липазами. Докинг 6 разных субстратов, в том числе производных 2,5-дикетоморфолина и эфиров N-оксиацил-аминокислот, в структуру липазы B из Candida Antarctica показал, что доля конформаций, удовлетворяющих критериям реакционноспособности, составляла не менее 30% от общего числа связавшихся конформаций для всех изученных субстратов. Расстояние от атома кислорода гидроксильной группы Ser105 до атома углерода карбонильной группы субстрата колеблется в пределах 3,2-3,8 Ангстрем, а расстояние между атомом кислорода карбонильной группы субстрата и оксианионным центром фермента находится в диапазоне 4-5 Ангстрем. Рассчитанные энергии связывания составляют −8 ÷ −6 ккал/моль. Результаты докинга дают основание полагать, что липаза может катализировать реакции с участием субстратов этого типа. Экспериментально была изучена активность ряда препаратов липаз. Активность каждого ферментного препарата изучали с использованием в качестве субстрата метилового эфира N-(R)-манделил-(S)-фенилаланина в двухфазной системе толуол-фосфатный буфер pH 7,5. Степень конверсии метилового эфира N-(R)-манделил-(S)-фенилаланина составила: 100 % (свиная панкреатическая липаза), 67% (липаза B из Candida antarctica), 14% (липаза «Солизим»), 5% (Novozyme 435), 3% (CALB CLEA). Таким образом, впервые показано, что липазы из различных источников в разных формах могут катализировать превращение этих ранее не изученных субстратов сложных эфиров N-манделил-(S)-аминокислот. Завершена разработка методики слежения за синтезом полимеров, основанной на анализе молекулярно-массового распределения полимерных и олигомерных соединений с помощью эксклюзионной хроматографии. Подобраны соответствующие колонки, подвижная фаза, аналитические стандарты полимеров, оптимизированы условия анализа. Построены калибровочные зависимости молекулярной массы полимерной фракции от времени удерживания для колонок с размерами пор 10000 и 50 Ангстрем, на основании которых определялись молекулярно-массовые характеристики синтезированных полиэфирамидов. Проведен поиск оптимальных условий биокаталитической полимеризации (3S,6S)-3-бензил-6-фенилморфолин-2,5-диона под действием свиной панкреатической липазы, впервые получены короткие депсипептидные олигомеры (димеры, 581 Да; тримеры, 862 Да и тетрамеры 1143 Да). Для доказательства строения синтезированных проведена реакция деградации, анализ продуктов разложения показал присутствие (S)-миндальной кислоты и (S)-фенилаланина – конечных продуктов превращения полидепсипептида в данных условиях. В отчетном году был впервые проведен синтез полидепсипептидов, биодеградируемых полимеров на основе амино- и оксикислот, с использованием двух биокаталитических стадий: стадии образования амидной связи между L-аминокислотой и оксикислотой, катализируемой пенициллинацилазой, с последующей циклизацией с образованием производного 2,5-дикетоморфолина под действием N,Nʹ-дициклогексилкарбодиимида, либо образования амидной связи между сложным эфиром L-аминокислоты и оксикислотой без последующей циклизации, и дальнейшей биокаталитической полимеризации образовавшихся мономеров под действием липаз.
3 9 января 2019 г.-26 декабря 2019 г. Разработка биокаталитических стадий получения полидепсипептидов – биодеградируемых полимеров на основе амино- и оксикислот
Результаты этапа: По результатам Проекта был разработан и апробирован способ получения полидепсипептидов – биодеградируемых полимеров на основе амино- и оксикислот, включающий в себя стадию образования амидной связи между L-аминокислотой и оксикислотой, катализируемую пенициллинацилазой, с последующей циклизацией с образованием производного 2,5-дикетоморфолина под действием N,Nʹ-дициклогексилкарбодиимида, либо образования амидной связи между сложным эфиром L-аминокислоты и оксикислотой без последующей циклизации, а также стадию биокаталитической полимеризации мономеров под действием липаз из различных источников. В качестве мономеров для ферментативной полимеризации и получения полиэфирамидов предложены три типа субстратов: производные 2,5-дикетоморфолина, сложные эфиры N-оксиацил-аминокислот и производные [1,4]оксазокан-5,8-диона. Производные 2,5-дикетоморфолина были впервые синтезированы хемоэнзиматическим способом из амида миндальной кислоты или галогенацетамидов и аминокислот с общим выходом 74-93% в пересчёте на L-энантиомер исходной аминокислоты. Показано, что эффективный препаративный синтез N-(R)-манделильных производных α-аминокислот может быть проведен с использованием мутантной формы пенициллинацилазы из E.coli βD484N, обладающей высокой стабильностью в щелочной среде и устойчивой к инактивации под действием высоких концентраций субстратов. При этом установлено, что в реакциях ацильного переноса на аминогруппу сложных эфиров аминокислот можно использовать пенициллинацилазу дикого типа из Escherichia coli. Показана необходимость учёта стереоселективности пенициллинацилаз по отношению к ацильному донору: при использовании амида (S)-миндальной кислоты более эффективным катализитором являлась пенициллинацилаза из Alcaligenes faecalis, в то время как пенициллинацилаза из Escherichia coli эффективнее работала с амидом (R)-миндальной кислоты, причем эта закономерность оказалась справедлива как в случае ацильного переноса на свободный аминокислоты, так и на сложные эфиры аминокислот. Расширен круг синтезируемых с помощью предложенного метода производных 2,5-дикетоморфолина за счёт использования галогенацетамидов как субстратов в реакциях ацильного переноса, катализируемых пенициллинацилазой. Разработана новая методика синтеза потенциального мономера для получения биоразлагаемых полиэфирамидов, восьмичленного лактонного соединения – [1,4]оксазокан-5,8-диона, отличающаяся от известной в литературе тем, что позволяет получить целевое соединение с более высоким выходом в кристаллической форме. Впервые с применением биокатализа получен ряд бифункциональных мономеров, в том числе функционализированных диолов и оксикислот, которые могут быть использованы как для получения индивидуальных гомополимеров, так и в качестве «вставок», в том числе в местах разветвления, при синтезе блок-сополимеров. Полученные с помощью реакций переэтерификации под действием липаз мономеры представляют из себя диолы с внутримолекулярными амидными связями на основе этиленгликоля, окси- и аминокислот, а также оксикислоты на основе этиленгликолевых и глицериновых эфиров глутаровой кислоты. Показана способность липаз из разных источников катализировать реакции с участием сложных эфиров N-манделил-аминокислот. Изучена стабильность липаз в условиях реакции полимеризации: липаза B из Candida antarctica в свободной форме и иммобилизованная на акриловой смоле (препарат Novozym 435), а также свиная панкреатическая липаза сохраняют до 60% от начальной активности при инкубации в условиях полимеризации. Разработана методика анализа молекулярно-массовых характеристик полимерных продуктов, основывающаяся на методе эксклюзионной хроматографии, где неподвижной фазой служит пористый полистирол, сшитый дивинилбензолом, а элюентом является дихлорметан. Построены калибровочные зависимости времени выхода фракций полистирола от молекулярной массы стандартных аналитических образцов. Проведённые серии реакций биокаталитической полимеризации под действием липаз показали возможность получения полиэфирамида со среднечисловой молекулярной массой до 40 кДа из мономера [1,4]оксазокан-5,8-диона, а также олигомерных депсипептидов на основе остатков миндальной кислоты, фенилаланина и фенилглицина с молекулярными массами от 1 до 5 кДа как в присутствии растворителя, так и в расплаве мономеров. Методом анализа продуктов разложения полученных полидепсипептидов доказана их ожидаемая структура.\

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".