|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Моделирование строения и свойств биомолекул для многоцветной флуоресцентной визуализации в живых системах НИР
Modeling structures and properties of biomolecules for live cell multicolor imaging
- Руководитель НИР: Григоренко Б.Л.
- Ответственный исполнитель: Хренова М.Г.
- Участники НИР: Капуста Д.П., Коц Е.Д., Кулакова А.М., Лычко Л.А., Метелешко Ю.И., Миронов В.А., Поляков И.В.
- Подразделение: Кафедра физической химии
- Срок исполнения: 1 января 2017 г. - 31 декабря 2019 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 17-13-01051
- Номер ЦИТИС: АААА-А17-117042810118-0
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Живые системы, медицинские технологии, медицинская химия и новые лекарственные средства
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Стратегические информационные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.15.03 Теория строения молекул и химической связи
-
Ключевые слова:
квантовая химия, квантовая механика – молекулярная механика, фитохромы, органические хромофоры, оптические спектры, флуоресцентные биомолекулы, флавин-содержащие белки, производные зеленого флуоресцентного белка, возбужденные электронные состояния, молекулярное моделирование
phytochromes, quantum chemistry, organic chromophores, excited electronic states, derivatives of green fluorescent protein, flavin-containing proteins, quantum mechanics - molecular mechanics, fluorescent biomolecules, optical spectra -
Описание:
Проект направлен на определение оптимальных параметров и прогнозирование новых вариантов биомолекул и их наборов – перспективных маркеров для многоцветной флуоресцентной визуализации в живых системах по результатам компьютерного моделирования на основе квантовой теории. В настоящее время нарастают потребности в разработках таких меток, которые позволяют проследить несколько разных, но взаимосвязанных событий в живой системе, проводя мониторинг оптических спектров от разных флуорофоров, присоединенных к соответствующим мишеням. В качестве полезных биомолекул для многоцветной визуализации рассматриваются варианты на основе зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP) или GFP-подобные белки, флавин-содержащие белки и новые варианты маркеров на основе фитохромов с наиболее длинноволновыми полосами в оптических спектрах. За переходы между электронными состояниями в этих трех классах природных биомолекул отвечают различные органические хромофоры с сопряженной системой π-электронных связей, находящиеся внутри белковых матриц. Настройка свойств маркеров для достижения заданных параметров (в частности, положений и интенсивностей полос в спектрах поглощения и испускания, квантового выхода, фотостабильности) экспериментально осуществляется модификацией окружения хромофора за счет точечных мутаций в белковых матрицах, а также модификацией хромофора. Именно в этой части большой исследовательской области, направленной на создание новых флуоресцентных меток на основе природных биомолекул для многоцветной визуализации в живых системах, компьютерное моделирование содействует экспериментальным исследованиям. Результаты расчетов структуры и оптических спектров для вариантов перечисленных природных систем (GFP-подобных, флавин-содержащих, фитохромов), выполненные в рамках единообразной методики на основе квантовой теории строения молекул, позволят определить пути рационального дизайна биомолекул с заданными свойствами. Основным инструментом моделирования предполагается метод квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) с отнесением к квантовой подсистеме хромофор-содержащей области и учетом остальной части белковой макромолекулы в рамках молекулярной механики. Предполагается активное использование оригинальной методики и компьютерных программ метода КМ/ММ в варианте конформационно-подвижных эффективных фрагментов. Расчеты структурных параметров в основном электронном состоянии будут проводиться с использованием квантово-химических методов теории функционала электронной плотности (DFT) для КМ-подсистемы и силовых полей AMBER, CHARMM для ММ-подсистемы. Оптимизация геометрических параметров в возбужденных электронных состояниях будет проводиться с использованием многоконфигурационных подходов (CASSCF, CIS) для квантовых подсистем. Расчеты электронных переходов между основным и возбужденными состояниями будут выполнены методами CASSCF с последующим учетом поправок в рамках многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущений (xMCQDPT2).
-
Abstract:
The project aims to determine the optimal parameters and predict novel variants of biomolecules and their sets - promising markers for multicolor fluorescence imaging in living systems based on the results of quantum based computer simulations. There is a current request for the development of such labels, which allow one to trace a number of different, but related events in a living system, monitoring the optical spectra of different fluorophores attached to the respective targets. The following biomolecules are considered as the most useful for multicolor imaging: variants of green fluorescent protein (GFP) or GFP-like proteins, flavin-containing proteins, and phytochromes, the new markers characterized by the longest wavelengths in the optical spectra. Transitions between electronic states in these three classes of natural biomolecules are due to various organic chromophores with a conjugated π-electron system inside the protein matrices. Tuning properties of these markers in order to achieve the desired parameters (in particular, the positions and intensities of the bands in the absorption and emission spectra, quantum yield, photostability) is performed experimentally by modifying the environment of the chromophore by point mutations in the protein matrix, as well as modification of the chromophore. Computer simulations facilitate experimental studies in this particular part of the large field of research aimed at creating new fluorescent labels based on natural biomolecules for multicolor imaging in living systems. The results of calculations of the structure and optical spectra for the listed natural systems (GFP-like, flavin-containing phytochrome) carried out at a uniform theoretical level based on the quantum theory of molecular structure, will highlight the ways of rational design of biomolecules with the desired properties. The main modeling tool will be the method of quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) with an assignment of the chromophore-containing region to the quantum subsystem and taking into account the rest of the protein molecule within the molecular mechanics. The active use of the original methodology and computer programs of the QM/MM method with the flexible effective fragments is planned. Calculations of structural parameters in the electronic ground state will be carried out with the use of density functional theory (DFT) quantum-chemical methods in the QM subsystems and force fields AMBER, CHARMM for MM subsystems. Optimization of geometry parameters in the excited electronic states will be performed with the multiconfigurational approaches (CASSCF, CIS) for quantum subsystems. Calculations of electronic transitions between ground and excited states will be performed with the CASSCF-based methods followed by corrections within the multiconfigurational quasi-degenerate perturbation theory (xMCQDPT2).
-
Планируемые результаты:
Результатом работ по проекту будут рекомендации оптимальных наборов биомолекул для применения в качестве флуоресцентных меток, различающихся диапазонами спектральных полос поглощения и испускания, из трех классов природных объектов - GFP-подобных белков, флавин-содержащих флуоресцентных белков и фитохромов. В литературе довольно широко представлены результаты расчетов параметров молекулярных систем, моделирующих хромофоры и фрагменты GFP-подобных белков; для флавин-содержащих флуоресцентных белков и фитохромов известны лишь единичные расчеты. Важно отметить, что по литературным данным практически невозможно подобрать наборы разных потенциальных маркеров, необходимых для многоцветных флуоресцентных меток, характеризованных на одном теоретическом уровне. В данном проекте будут рекомендованы такие наборы биомолекул по результатам моделирования в рамках единой схемы. На начальной стадии проекта будут выполнены работы по оптимизации вариантов GFP-подобных и флавин-содержащих флуоресцентных белков, предсказанных ранее (2013-2015 гг) участниками проекта, и прошедших первичную экспериментальную проверку в других лабораториях. Будут предложены новые варианты цветных белков семейства GFP с хромофором, построенным по мотивам «трёхэтажного (triple-decker) сэндвича». Будут предложены новые варианты флуоресцентных маркеров для флавин-содержащих биомолекул. На последующих стадиях будут предсказаны оптимальные варианты фитохромов для многоцветной визуализации. Итоговым результатом проекта будут рекомендации наборов биомолекул, составленных из рассмотренного ряда GFP-подобных белков, флавин-содержащих белков, фитохромов, для совместимой многоцветной визуализации в живых системах. Все предполагаемые работы должны привести к результатам, соответствующим мировому уровню моделирования свойств биологических флуорофоров.
-
Научный задел:
Основные достижения последних лет относятся к последовательному применению метода квантовой механики – молекулярной механики (КМ/ММ) для моделирования процессов в белках. Продолжается совершенствование и развитие предложенной ранее оригинальной методики КМ/ММ с конформационно-подвижными эффективными фрагментами; новые разработки изложены, в частности, в кандидатской диссертации Д.И.Морозова (руководитель Б.Л.Григоренко), успешно защищенной в 2012 г. С использованием компьютерных программ КМ/ММ, ориентированных на современные суперкомпьютеры, исследован большой круг вопросов по фотохимическим свойствам зеленого флуоресцентного белка. Помимо оригинальных публикаций эти результаты вошли в написанные с участием Б.Л.Григоренко два обзора: в 2012 г в авторитетном журнале Accounts of Chemical Research "Quantum chemistry behind bioimaging: Insights from ab initio studies of fluorescent proteins and their chromophores", Accounts of Chemical Research, 2012, 45(2):265–275; и в 2016 г в одном из наиболее важных химических журналов Chemical Reviews, "Photoinduced chemistry in fluorescent proteins: Curse or blessing?", Chemical Reviews, 2016, available online October 18 2016, DOI: 10.1021/acs.chemrev.6b00238. Другое направление применений методики КМ/ММ связано с моделированием реакций ферментативного катализа. Пример одной из последних публикаций: Grigorenko B.L., Knyazeva M.A., Nemukhin A.V. "Analysis of proton wires in the enzyme active site suggests a mechanism of c-di-GMP hydrolysis by the EAL domain phosphodiesterases", Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, 2016, 84, 670-1680, DOI: 10.1002/prot.25108.
- Добавил в систему: Григоренко Белла Людвиговна
Источник финансирования НИР
| грант РНФ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Моделирование строения и свойств биомолекул для многоцветной флуоресцентной визуализации в живых системах |
| Результаты этапа: Проект направлен на определение оптимальных параметров и прогнозирование новых вариантов биомолекулярных маркеров для многоцветной флуоресцентной визуализации в живых системах по результатам компьютерного моделирования на основе квантовой теории. В качестве практически важных биомолекул для многоцветной визуализации рассматриваются флавин-содержащие белки (поглощение и испускание между 450 и 550 нм), маркеры на основе зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP) и/или GFP-подобные белки (поглощение и испускание между 400 и 650 нм), и новые варианты маркеров на основе фитохромов с оптическими полосами в ближней инфракрасной области спектра (поглощение и испускание между 640 и 720 нм). За переходы между электронными состояниями в этих трех классах природных биомолекул отвечают различные органические хромофоры с сопряженной системой π-электронных связей, находящиеся внутри белковых матриц. Настройка свойств маркеров для достижения заданных параметров (в частности, положений и интенсивностей полос в спектрах поглощения и испускания, квантового выхода, фотостабильности) осуществляется модификацией окружения хромофора за счет точечных мутаций в белковых матрицах, а также модификацией хромофора. В полном соответствии с заявкой, в работах первого года проекта проводились исследования вариантов GFP-подобных белков с хромофорами, построенными по мотивам «трёхэтажного (triple-decker) сэндвича», а также вариантов флавин-содержащего белка iLOV. На основе компьютерных расчетов предсказан вариант красного флуоресцентного белка с хромофором (Chro), зажатым между двумя ароматическими кольцами аминокислотных остатков тирозина по мотивам «трёхэтажного (triple-decker) сэндвича». Согласно нашему предыдущему (2013 г.) теоретическому предсказанию, такой тирозин-хромофор-тирозин комплекс с π-стэкингом может быть осуществлен в зеленом флуоресцентном белке (GFP). В недавнем (2016 г.) экспериментальном исследовании была сделана попытка реализовать подобный мотив, и был получен вариант красного белка под названием mRojoA-VYGV с двумя аминокислотными остатками тирозина, окружающими хромофор. Однако, анализ кристаллографической структуры показал, что в π-стэкинге участвовала только пара тирозин-хромофор, тогда как второй тирозин был ориентирован перпендикулярно по отношению к хромофору. Мы предлагаем более перспективный вариант этого красного флуоресцентного белка с хромофором, построенным по мотивам «трёхэтажного (triple-decker) сэндвича», что достигается введением дополнительных мутаций в mRojoA-VYGV. Структуры и оптические свойства модельных белковых систем, основанных на структурах mCherry и mRojoA, рассчитаны методами QM(DFT)/MM. Электронные переходы в связанных с белками хромофорах вычислены современными методами квантовой химии. Согласно нашим расчетам, хромофор в новом варианте красного флуоресцентного белка стабилен внутри белковой макромолекулы, и его оптические полосы сдвинуты в красную сторону относительно исходных белков mCherry и mRojoA. Предложены новые варианты флуоресцентного маркера в живых клетках iLOV с флавин-содержащим хромофором. Первые попытки (2015, 2016 гг) улучшить спектральные свойств iLOV показали, что единичная замена Q489K может привести к перспективному варианту, но практическая реализация (2016 г) не была успешной из-за неблагоприятной конформации, отворачивающей гибкую боковую цепь аминокислотного остатка лизина от хромофора. Новые результаты молекулярного моделирования показывают, что расположение заряженного остатка лизина вблизи изоаллоксазинового кольца хромофора может быть зафиксировано путем введения дополнительных мутаций в iLOV. Методами классической и квантовой молекулярной динамики с последующей оптимизацией структур методом QM/MM в основном и возбужденном состояниях несколько перспективных вариантов мутантов iLOV. Энергии перехода между состояниями S0 и S1 вычисляются с использованием современных квантовохимических методов TD-DFT, SOS-CIS(D) и XMCQDPT2. Согласно нашим расчетам, хромофор-содержащие карманы для вариантов iLOV, содержащих лизин либо в положении 392 (вариант V392K/F410V/A426S), либо в положении 489 (вариант Q489K/L470T) должны быть стабильными и иметь полосы поглощения и излучения сдвинутыми на 40-50 нм в сторону более длинных волн относительно iLOV. | ||
| 2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Моделирование строения и свойств биомолекул для многоцветной флуоресцентной визуализации в живых системах |
| Результаты этапа: В полном соответствии с планом в работах второго года проекта проводились исследования модельных систем, описывающих варианты модифицированных бактериальных фитохромов с ковалентно пришитым хромофором – биливердином, исследования вариантов флавин-содержащего белка iLOV с замещенными флавинами, исследование механизма обратимо фотопереключаемого GFP-подобного белка Dreiklang. Рассчитаны структуры и спектры возбуждения системы, моделирующей домен бактериофитохрома с ковалентно пришитым линейным тетрапирролом – биливердином. Данный вариант, называемый IFP1.4, рассматривается как перспективный инфракрасный флуоресцентный маркер. В наших расчетах методами КМ/ММ были определены равновесные геометрические параметры и решена важная задача о состоянии протонирования пиррольных колец. Построены две конформации хромофора, соответствующие формам Pr и Pfr; в последнем случае кольцо D повернуто относительно ковалентно пришитой к белку (через аминокислотный остаток цистеина) остальной части биливердина. Показано, что с найденными по результатам расчетов КМ/ММ геометрическими параметрами можно практически количественно воспроизвести положения максимумов полос в спектрах возбуждения. Результаты работы опубликованы: Polyakov I.V., Grigorenko B.L., Mironov V.A., Nemukhin A.V. “Modeling structure and excitation of biliverdin-binding domains in infrared fluorescent proteins”, Chemical Physics Letters, 2018, 710, 59-63; DOI: 10.1016/j.cplett.2018.08.068. Рассмотрен механизм формирования фитохромного белка miRFP670 – маркера в ближней инфракрасной области. Согласно экспериментальным данным в доменах бактериофитохрома PAS и GAF могут образовываться ковалентные аддукты при связывании биливердина как через остаток цистеина только из одного домена, так и через два остатка цистеина из разных доменов. Столь необычный механизм формирования фиохрома был проверен методами молекулярного моделирования. По результатам моделирования методами КМ/ММ и молекулярной динамики с потенциалами КМ/ММ сформулированы механизмы реакции взаимодействия биливердина с остатками цистеина из доменов PAS и GAF. Рассчитанные энергетические профили и результаты анализа кинетических уравнений с оцененными по теории переходного состояния констанами скорости элементарных стадий показывают, что возможны оба канала реакции. Результаты работы опубликованы: Khrenova M.G., Kulakova A.M., Nemukhin A.V. “Competition between two cysteines in covalent binding of biliverdin to phytochrome domains”, Organic and Biomolecular Chemistry, 2018, 16, 7518-7529; DOI: 10.1039/c8ob02262c. Методами молекулярного моделирования, включающими методы молекулярной динамики и квантовой механики/молекулярной механики, показано, что введением точечных мутаций и заменой флавинмононуклеотида (FMN) на кофакторы с замещенными флавинами 8-амино-FMN, 8-метиламино-FMN, 1-деазо-FMN в структуре флуоресцентного белка на основе флавина iLOV можно получить варианты белков с полосами поглощения и испускания в оптических спектрах значительно сдвинутыми в красную сторону по сравнению с исходным белком iLOV. Варианты с 1-деазо-FMN хромофором характеризуются полосами испускания, попадающими в окно прозрачности биологических тканей. Варианты с 8-амино-FMN, 8-метиламино-FMN замещенными (и с соответствующими точечными заменами аминокислотных остатков) приводят к композициям, удобным для FRET пар. Результаты опубликованы и доложены на научных конференциях (1) Meteleshko Yu.I., Nemukhin A.V., Khrenova M.G. “Novel flavin-based fluorescent proteins with red-shifted emission bands: a computational study”, Photochemical and Photobiological Sciences, 2018, XXX; DOI: 10.1039/C8PP00361K (2) XXX Симпозиум «Современная химическая физика», 16-27 сентября 2018 г., Туапсе. Хренова М.Г., Метелешко Ю.И., Немухин А.В. «Молекулярное моделирование флуоресцентных белков на основе флавина и его производных» (устный доклад). (3) XVIII Ежегодная молодежная конференция c международным участием ИБХФ РАН-ВУЗы "БИОХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА", Москва, 14-15 ноября 2018 г. Метелешко Ю.И. «Молекулярное моделирование мутантов флуоресцентного белка iLOV с модифицированным хромофором» (устный доклад). Построены молекулярные модели белка Dreiklang в активном (ON) и неактивном (OFF) состояниях на основе структуры PDB ID: 3ST2 и определены состояния протонирования ключевых молекулярных групп в хромофор-содержащей области. Методами КМ(DFT)/ММ оптимизированы геометрические параметры ON и OFF систем в основном электронном состоянии S0. Показано, что рассчитанные энергии вертикальных электронных переходов хорошо согласуются с экспериментальными положениями максимумов в оптических спектрах поглощения. Методами КМ(CASSCF)/ММ рассчитаны энергетические профили для основного S0 и первого возбужденного S1 состояний системы, связывающие геометрические конфигурации активного и неактивного состояний, что позволяет предложить механизм обратимой фотоиндуцированной гидратации хромофора. | ||
| 3 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Моделирование строения и свойств биомолекул для многоцветной флуоресцентной визуализации в живых системах |
| Результаты этапа: По результатам расчетов методами молекулярной динамики (МД), квантовой химии и квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) определены характеристики молекулярных систем, моделирующих недавно разработанные маркеры на основе бактериофитохромов IFP1.4 (infrared fluorescent protein, version 1.4) и smURFP (small ultra-red fluorescent protein). Построены трехмерные полноатомные модели белков, определены структурные параметры хромофор-содержащих областей в основном электронном состоянии, оценены вертикальные энергии возбуждения S0 → S1. Рассчитанные характеристики хорошо согласуются с экспериментальными данными - координатами атомов, определенными при рентгено-структурных исследованиях кристаллов белков, и положениями максимумов полос в спектрах возбуждения. Впервые найдены структуры минимумов на потенциальной поверхности возбужденного состояния и рассчитаны положения полос в спектрах флуоресценции S1 → S0, а также оценены структуры и энергии точек конических пересечений S1/S0. Полученные результаты позволяют объяснить невысокий квантовый выход флуоресценции белка IFP1.4 и сформулировать предложения для более перспективных вариантов. Определены индивидуальные параметры доноров и акцепторов пар биомаркеров – потенциальных участников резонансно-индуктивного переноса энергии (FRET-пар), для вариантов флуоресцентного белка iLOV, которые были предложены на предшествующих этапах проекта по результатам молекулярного моделирования. Варианты белка iLOV с расширенным оптическим диапазоном различаются как точеными мутациями аминокислотных остатков, так и составом хромофоров на основе флавинмононуклеотида (FMN). Методами квантовой химии и квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) определены максимумы положений полос в оптических спектрах поглощения и флуоресценции и соответствующие дипольные моменты электронных переходов в модельных системах. По результатам молекулярного моделирования установлен механизм термической реактивации флуоресцентного состояния фотопереключаемого GFP-подобного белка Dreiklang. Методами молекулярной динамики и квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) построены модели белка в не флуоресцирующем (с гидратированным хромофором) и флуоресцирующем состояниях и рассчитан энергетический профиль реакции реактивации в основном электронном состоянии. Найдено, что химическая реакция термической реактивации проходит через несколько элементарных стадий, в которых принимают участие группы основной полипептидной цепи белка и ближайшие к хромофору аминокислотные остатки Glu222, Ser205, His145. Опубликована статья (Feature Article), обобщающая результаты компьютерного моделирования флуоресцентных белков, используемых для многоцветной визуализации в живых системах (GFP-подобных белков, флавин-содержащих белков и фитохромов): “Computational Challenges in Modeling of Representative Bioimaging Proteins: GFP-Like Proteins, Flavoproteins, and Phytochromes”, Journal of Physical Chemistry B (2019, 123(29), 6133-6149; DOI: 10.1021/acs.jpcb.9b00591. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".