![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Проблема, на решение которой направлен проект, лежит на пересечении исследований по двум фундаментальным направлениям. Первое - взаимодействие кальция с митохондриями. С помощью ионов кальция осуществляется регуляция огромного числа внутриклеточных процессов. В ответ на стимулы кальций вбрасывается в цитоплазму из внешней среды либо из цистерн эндоплазматического ретикулума, вызывая тот или иной ответ, и затем откачивается обратно. Митохондрии умеют быстро и обратимо поглощать кальций из цитоплазмы по разности электрических потенциалов на внутренней мембране с помощью кальциевого унипортера и таким образом активно вмешиваются в формирование и передачу кальциевого сигнала внутри клетки. Кроме того, кальций действует и на сами митохондрии: в умеренных дозах он стимулирует окислительное фосфорилирование, а избыточное накопление кальция в матриксе приводит к гибели митохондрий, открытию так называемой «неспецифической поры», и запускает митохондриальную ветвь каскада клеточной смерти. Ключевую роль во взаимодействии кальция с митохондриями играет работа дыхательной цепи, создающей мембранный потенциал, по которому кальций закачивается в матрикс. До недавнего времени были известны два основные эффекта кальция на дыхание митохондрий: 1) поглощенный в матрикс кальций стимулирует ряд дегидрогеназ дыхательной цепи ; 2) внешний Ca активирует некоторые переносчики субстратов окисления. Нами недавно обнаружен третий тип воздействия кальция на дыхательную цепь: прямое ингибирование цитохром с оксидазы, путем присоединения катиона в специальном центре связывания. В предлагаемом проекте мы хотим исследовать механизм этого эффекта и определить его возможную роль в картине кальциевой регуляции метаболизма.
1. Исследовано взаимодействие ионов H+ с катион-связывающим центром (КСЦ) цитохромоксидазы (ЦО). С этой целью отработан метод эффективной замены детергента в препаратах ЦО выделенной из митохондрий сердца быка. Процедура предотвращает помутнение раствора цитохромоксидазы при кислотных значениях pH и позволила впервые исследовать спектральные свойства ЦО при значениях pH < 6. Ни в одном из случаев сдвиг pH от 8-9 до 6-4,5 не выявляет длинноволнового сдвига спектра поглощения гема a. Этот результат не подтверждает принятую в литературе точку зрения, основанную на косвенных данных, согласно которой ион H+ связываясь с ЦО, вызывает такой же спектральный сдвиг, что ионы кальция. Представляется вероятным, что однозарядные ионы H+ подобно однозарядным ионам Na+, связываются в КСЦ не вызывая спектрального сдвига гема а. Способность сдвигать спектр поглощения гема а является специфической особенностью двухзарядного катиона Ca2+ . 2. Впервые показано, что при не слишком высоких скоростях работы ЦО (около 10об/сек), реализуемых в физиологических условиях энергизованной мембраны, ионы Са2+ ингибируют ее активность. Эффект показан на выделенном ферменте сердца быка, где ингибирование достигает 60% с Кинг около 1мкМ близкой по значению Кд Са2+ из сайта связывания с ЦО, а также на разобщенных митохондриях, выделенных из разных тканей крысы, где показана тканеспецифичность ингибирования, достигающего 80% в митохондриях печени. Ранее ингибирующее действие Са2+ не удавалось заметить видимо потому, что принятым способом измерения активности является способ, при котором фермент работает максимально быстро (более 100 об/сек при рН8), а эти условия далеки от реальных физиологических условий в мембране. В качестве физиологического механизма воздействия связывания Са2+ обсуждается возможность того, что Са2+ может блокировать выход протонов из так называемого протонного канала Н, который, как предполагается, используется ЦО для перекачки протонов и запасания энергии. 3. Представлен новый экспериментальный подход, позволяющий определить индивидуальные оптические характеристики восстановленного гема а в цитохром c-оксидазе из сердца быка на основе небольшого избирательного сдвига его спектра поглощения при связывании ионов кальция. Разностный спектр вызываемого Ca2+ спектрального ответа, представляет собой фактически первую производную (дифференциал) абсолютного спектра поглощения гема а2+. Такой спектр был получен на цианидном комплексе цитохромоксидазы смешанной валентности (a2+a33+–CN) и использован как базовый спектр для моделирования. Индивидуальный спектр поглощения восстановленного гема а в полосе Соре реконструирован как первообразная разностного спектра, вызванного добавлением Ca2+. Полученный спектр гема а2+ в полосе Соре характеризуется максимумом при 447 нм и полушириной 17 нм и может быть представлен как сумма двух гауссовых полос с максимумами при 442 и 451 нм и полуширинами ~10 нм (589 см-1), соответствующих перпендикулярно ориентированным электронным пи->πи * переходам B0x и B0y в порфириновом кольце. Реконструированный спектр в области Соре сильно отличается от «классического» спектра поглощения восстановленного гема а, впервые описанного Ваннесте. Эти различия свидетельствуют, что суммарная γ-полоса поглощения гема а в цитохромоксидазе содержит кроме переходов B0x и B0y дополнительные компоненты, нечувствительные к ионам кальция.
РФФИ | Соисполнитель |
РФФИ | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 10 января 2011 г.-31 декабря 2013 г. | Механизм регуляции цитохромоксидазы митохондрий ионами кальция |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".