![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Внедрение методов стереоселективного биокаталитического синтеза пептидов и пептидомиметиков в водной среде, а также методов ферментативного введения и снятия защитных групп должно повысить чистоту получаемых продуктов и снизить использование органических растворителей, которые вносят наибольший вклад в образование отходов промышленного химического и фармацевтического синтеза. В данном проекте будут проведены исследования возможностей применения ферментов в трех направлениях. Будет разработан метод стереоселективного ферментативного синтеза для препаративного получения N-ацильных производных цистеина и глутатиона - недавно открытых селективных ингибиторов одной из изоформ глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека. Будут выявлены оптимальные условия биокаталитического процесса (выбор ацильного донора, концентрации субстратов, фермента, рН среды, температура), осуществлен выбор биокатализатора. Будут исследованы возможности ферментативного введения и снятия защитных групп в синтезе пептидов и пептидомиметиков, изучена специфичность биокатализаторов к ацильным донорам, зависимость стереоселективности фермента к нуклеофилу и способности к ацильному переносу от природы ацильного донора. Предварительные исследования показывают, что как стереоселективность к нуклеофилу, так и эффективность ферментативного ацильного переноса зависят от структуры ацильного донора и поэтому при выполнении проекта будет чрезвычайно важно сделать обоснованный выбор оптимальных ацильных доноров для проведения препаративных реакций. Будут исследованы возможности ферментативного синтеза пептидомиметиков – производных неприродных аминокислот, аминоспиртов и первичных аминов.
Stereoselective biocatalytic synthesis of peptides and peptidomimetics in an aqueous medium, as well as methods of enzymatic protection and deprotection, can improve the purity of the products obtained and reduce the use of organic solvents that make great contribution to the industrial waste formation. In this project, studies will be carried out on the possibilities of using enzymes in three directions. A method of stereoselective enzymatic synthesis will be developed for the preparative preparation of N-acyl derivatives of cysteine and glutathione, the recently discovered selective inhibitors of one of the isoforms of human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Optimal conditions of the biocatalytic process will be revealed (selection of the acyl donor, substrate concentration, enzyme, pH of the medium, temperature), biocatalyst selection. The possibilities of enzymatic introduction and removal of protective groups in the synthesis of peptides and peptidomimetics will be investigated, the specificity of biocatalysts to acyl donors, the dependence of the stereoselectivity of the enzyme on the nucleophile and the ability to acyl transfer from the nature of the acyl donor are studied. Preliminary studies show that both the stereoselectivity to the nucleophile and the efficiency of enzymatic acyl transfer depend on the structure of the acyl donor and therefore it will be extremely important for the project to make an informed choice of the optimal acyl donors for carrying out the preparative reactions. The possibilities of enzymatic synthesis of peptidomimetics - derivatives of unnatural amino acids, aminoalcohols and primary amines - will be investigated.
Будет разработан метод стереоселективного ферментативного синтеза производных цистеина без использования защитных групп и проведен препаративный синтез N-ацильных производных цистеина и глутатиона – ингибиторов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАДФ) человека. Будет разработана методика слежения за протеканием биокаталитического синтеза, энантиомерной чистотой получаемых продуктов. Будет изучена кинетика избирательного ферментативного ацилирования аминогруппы цистеина и глутатиона различными ацильными донорами без предварительной защиты сульфгидрильной группы. Будут созданы биокатализаторы на основе пенициллинацилаз дикого типа и их мутантных форм, обладающие высокой стабильностью в щелочной среде и устойчивостью в условиях препаративного использования. Будет изучена возможность использования пенициллинацилаз для введения и снятия защиты функциональных групп в синтезе пептидов и пептидомиметиков. Будет исследована возможность использования ферментов для синтеза пептидомиметиков на основе неприродных аминокислот, фосфоновых аналогов аминокислот, D-аминокислот, аминоспиртов, первичных аминов, бета и гамма-аминокислот, будут выявлены оптимальные формы биокатализаторов. Будет изучена возможность оптимального сочетания ферментативных стадий (образования пептидной связи, а также стадий введения и снятия защитных) со стадиями химического синтеза при получении пептидов и пептидомиметиков. Будет проведена оптимизация методов ферментативного препаративного синтеза пептидов и пептидомиметиков. Результаты исследований, проведенных по проекту, будут опубликованы в рецензируемых научных изданиях.
Коллектив имеет обширный опыт работы с пенициллинацилазами из различных источников, использования широкой субстратной специфичности пенициллинацилазы в тонком органическом синтезе. Ранее в нашей лаборатории в сотрудничестве с отделом биохимии животной клетки нашего института (лаборатория под руководством профессора В.И. Муронца) были открыты необратимые селективные ингибиторы одной из изоформ глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека, представляющие собой N-ацильные производные цистеина и глутатиона. Эти соединения представляют интерес как перспективные лекарственные препараты. Использование биокаталитических методов является перспективным для получения данных препаратов, так как позволяет избежать стадий введения и снятия защитных групп для сульфгидрильной и аминогруппы, которые необходимы при использовании методов химического синтеза. Членами нашего коллектива были получены мутантные формы пенициллинацилазы с улучшенной энантиоселективностью, стабильностью в щелочной среде в условиях необходимых для синтеза соединений этого класса, а также устойчивых к инактивирующему действию высоких концентраций субстратов. Разработаны методы хирального анализа аминосоединений, используемые для слежения за протеканием ферментативных реакций. Накоплен большой опыт в экспериментальном исследовании кинетики ферментативных реакций, построении адекватных математических моделей, позволяющих описать поведение реакций во времени и их оптимизации. Разработаны методики изучения кинетики инактивации ферментов в ходе реакции. Сильной стороной проекта является комплексное использование современных подходов инженерной энзимологии, молекулярного моделирования и теоретической химии. Для выполнения проекте сформирован коллектив исследователей из нескольких подразделений МГУ.Члены коллектива имеют опыт совместной работы, получены предварительные результаты, свидетельствующие о перспективности проекта.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 21 апреля 2017 г.-1 декабря 2018 г. | Использование пенициллинацилазы для стереоселективного синтеза пептидов и пептидомиметиков |
Результаты этапа: 1. Разработан метод стереоселективного ферментативного синтеза производных цистеина и глутатиона без использования защитных групп Показано, что ферментативное ацилирование цистеина протекает весьма эффективно, исключительно по аминогруппе. Наибольшая скорость синтеза достигается при использовании фенилацетамида и амидов R-миндальной кислоты и R-фенилглицина. Высокий выход целевого продукта (75-89%) обеспечивается достаточно высоким отношением начальных скоростей синтеза и гидролиза (S/H). Для неспецифических амидов феноксиуксусной и S-миндальной кислоты - при общем замедлении реакции наблюдается увеличение эффективности ацильного переноса (S/H) и, как следствие, выхода продукта ацилирования (до 95%). В отличие от случая с цистеином, в следствие значительного снижения отношения S/Н, ацильный перенос на глутатион менее эффективен. Выход целевого продукта составляет 65-80%. Однако, рассмотренные реакции протекают очень быстро, быстрее чем ферментативный гидролиз природных субстратов с такими же ацильными донорами. 2. Проведен препаративный синтез N-ацильных производных цистеина и глутатиона. Для N-фенилацетил-глутатиона выход составил 65%, для N-феноксиацетил-L-цистеина – 95%, для N-(R)-манделил-(S)-цистеина – 85%). Все синтезированные тиолы характеризовались высокой химической и оптической чистотой (ee>99,9%) 3. Разработаны методики слежения за протеканием биокаталитического синтеза, выделения и очистки целевых соединений, энантиомерной чистотой получаемых продуктов. Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили с помощью обращенно-фазовой хроматографии (ВЭЖХ). Разделение проводили элюированием водно-ацетонитрильной смесью (pH3) с добавлением ион-парного реагента (додецилсульфат натрия) на колонках с С18-фазой. Продукт выделяли осаждением при подкислении реакционной смеси и очищали перекристаллизацией за счет растворения в щелочном буфере или органическом растворителе (см.табл.й). Оптическую чистоту определяли с помощью оригинальной методики, разработанной в лаборатории [Guranda, 2005], которая состояла в предварительной модификации свободных аминогрупп о-фталевым альдегидом и хиральным тиолом. В качестве тиолсодержащего соединения использовали N-ацетил-S-цистеин. 4. Была изучена кинетика избирательного ферментативного ацилирования аминогруппы цистеина различными ацильными донорами без предварительной защиты сульфгидрильной группы. Для увеличения скорости реакции представляется оптимальным использовать «быстрые» доноры (фенилацетамида, амиды R-миндальной кислоты и R-фенилглицина) и повышенные температуры. Для увеличения выхода представляется оптимальным использовать «производительные» доноры (амиды феноксиуксусной и S-миндальной кислоты), высокие концентрации реагентов, избыток ацильного донора, повышенные температуры, рациональный выбор pH на базе «субстратной инженерии». При этом предварительной защиты SH-группы не требуется. Показана принципиальная возможность переноса на цистеин Z-группы и «промежуточного» бромацильного радикала. Однако, требуется учитывать инактивацию фермента в присутствии данных субстратов. При использовании бромацильного радикала необходимо дополнительно защищать SH-группу. 5. В качестве катализатора были использованы препараты пенициллинацилазы дикого типа и мутантный препарат фермента по остатку b484, полученный в результате рационального дизайна и обладающий более высокой стабильностью в щелочной среде и устойчивостью в концентрированных растворах реагентов. Нами было показано, что введение всего лишь одной мутации bD484N увеличивает стабильность фермента в присутствии 200мМ амида R-фенилглицина в 7 раз при pH9.5. Изменения каталитических свойств при этом не наблюдается. Было изучено влияние субстратов и строения используемых ацильных доноров на операционную стабильность ферментных препаратов. Нами было обнаружено, что как при увеличении гидрофобности ацильного донора (Phe>ФГ), так и при увеличении pH наблюдается падение операционной стабильности фермента. В то же время для разных стереоизомеров не наблюдается сколько-нибудь существенных отличий в инактивации фермента. 6. Были выявлены оптимальные условия (выбор ацильного донора, биокатализатора, концентрации субстратов, фермента, рН среды, температура) для проведения препаративного ферментативного синтеза ингибиторов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Было показано,что одной из главных точек оптимизации, является «субстратная инженерия». Для синтеза ингибиторов есть возможность выбрать более «быстрый», «производительный», «стереоселективный», а также «промежуточный донор». Также было показано, что выход реакции увеличивается при повышении концентраций обоих субстратов, а также при избытке донора ацильной части Однако, высокие концентрации некоторых субстратов приводят к тому, что фермент из E.coli быстро теряет свою операционную стабильность. Этого частично удается избежать при использовании стабилизированных препаратов фермента (мутант ПА E.coli по позициям bD484N). Оптимизацию pH следует проводить с тех позиций, что высокие pH (10-10,5), с одной стороны, наиболее оптимальны для ацильного переноса на аминогруппу, а с другой стороны, следует выбирать такое значение pH, при котором наблюдается высокая растворимость исходных реагентов и низкая растворимость продукта переноса (зависит от ацильного донора). Также необходимо учитывать, что природный фермент из E.coli обладает значительно пониженной стабильностью в области высоких pH, по сравнению с ферментом из Alcaligenes f. и необходимо использовать стабилизированную мутантную (bD484N) 7. Было проведено выделение и очистка ферментных препаратов, с помощью техники осмотического шока в градиенте сахарозы (от 20% до 0%) и последующих стадиях очистки в градиенте сульфата аммония (фракция от 1,5М до 2,9М). Проведена иммобилизация фермента и выбрана оптимальная форма биокатализатора для проведения препаративного синтеза N-ацильных производных цистеина. Показано, что иммобилизация не оказывает существенного влияния на кинетические свойства фермента ПА Alcaligenes f. 8. Была изучена специфичность фермента к ацильным донорам (фенилацетамиду, феноксиацетамиду, фенилглицинамиду, п-гидроксифенилацетамиду), зависимость стереоселективности фермента к нуклеофилу и способности к ацильному переносу от природы ацильного донора. Определены значения кинетических параметров, характеризующих эффективность и стереоселективность ферментативного ацильного переноса, и проведен анализ их зависимости от природы донора ацильной части. Обнаружено, что при использовании «производительного» феноксиацетамида увеличивается эффективность ферментативного ацилирования (параметры α и β), а стереоселективность выше в случае амидов R-фенилглицина и R-миндальной кислоты. Наиболее «быстрым» является природный фенилацетамид. Таким образом, как стереоселективность к нуклеофилу, так и эффективность ферментативного ацильного переноса зависят от структуры ацильного донора и поэтому очень важен выбор оптимального ацильного донора при проведении препаративных реакций. Дополнительно нами была показана возможность использования бромацетамида в качестве «промежуточного донора», однако вследствие необратимой инактивации необходимо проводить синтез при пониженных температурах (4°C). 9. Были исследованы возможности ферментативного введения и снятия защитных групп (бензилоксикарбонильной, феноксиацетильной, фенилацетильной, фенилглицильной) в пептидном синтезе. Проверена возможность снятия Z-защиты с ряда L-аминокислот с помощью пенициллинацилаз из Escherichia.coli и Alcaligenes.f. Показано, что Z-L-Ala является наилучшим субстратом. Для фермента из E.coli наблюдали более высокую каталитическую константу, но в то же более слабое связывание. Была исследована возможность ацильного переноса Z-группы с Z-L-Ala как наилучшего субстрата на нуклеофил глицин и фенилглицин. Показано, что уже при низких концентрациях процесс проходит достаточно эффективно, однако существенный вклад вносит неожиданно обнаруженная инактивация фермента.(*) 10. Были исследованы возможности ферментативного синтеза пептидомиметиков – производных неприродных аминокислот, аминоспиртов и первичных аминов . Показано, что ПА A.faecalis является эффективным катализатором ацилирования аминов и аминоспиртов в водных растворах. Для фенилэтиламина и фенилглицинола ферментативное ацилирование является энантиоселективным и может быть использовано для препаративного получения индивидуальных энантиомеров. Установлено, что в рассматриваемом ряду аминосоединений амин является более активным и эффективным (S/H) нуклеофилом, чем аминоспирт. А для стереоселективности зависимость обратная. Показано, что стереоселективность очень сильно зависит от пространственной организации молекулы (**). Было установлено, что при ацилировании аминов и аминоспиртов, в отличие от аминокислот, соотношение (S/H)0 строго линейно возрастает с увеличением концентрации нуклеофила. Что говорит об остсутствии влияния параметра γ (***). Введение мутаций ПА E.coli по позиции bF71L позволяет добиться существенного увеличения энантиоселективности, скорости и эффективности ацилирования фенилаланинола. Введение мутации bF71A приводит к увеличению стереоселективности для данного соединения в 250 раз! (****) * Неожиданно нами было обнаружена инактивация фермента в присутствии Z-L-Ala. В дальнейшем нами было установлено, что инактивация фермента Z-L-аминокислотами pH-зависимая и наиболее проявляется в щелочных условиях. С помощью масс-спектрометрии мы доказали ее необратимый и ковалентный характер. На наш взгляд, детальное изучение механизма столь необычного ингибирования заслуживает дополнительного экспериментального и теоретического изучения (математическое моделирование кинетики процесса) ** Удивительно, но зависимость эта настолько тонкая, что различие всего лишь в одном метильном радикале может привести к увеличению стереоселективности на 3 порядка! *** В свете этого наблюдения, было бы нтересно выяснить, что на самом деле скрывает в себе параметр γ? На наш взгляд стоило бы экспериментально проверить гипотезу связывания второй молекулы нуклеофилоа-кислоты с одним из положительных заряженных радикалов активного центра фермента. **** Для нас было неожиданно, что эффект от одной лишь мутации может привести к увеличению стереоселективности на 2 порядка! Это позволяет проводить реакцию непосредственно из рацемата и выделять оптически чистый продукт с большим энантиомерным избытком (99.7%). Столь высокий эффект от столь малого изменения, на наш взгляд, заслуживает подробного изучения как кинетически, там и с привлечением методов молекулярного моделирования (докинг и молекулярная динамика). | ||
2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Использование пенициллинацилазы для стереоселективного синтеза пептидов и пептидомиметиков |
Результаты этапа: 1. Проведено системное изучение общего механизма реакции трансфера Z-группы, катализируемого пенициллинацилазой и сопровождаемого необратимой инактивацией. Предложена минимальная кинетическая схема, адекватно описывающая кинетику реакции. Детально изучена кинетика инактивации пенициллинацилазы. Определены основные точки минимизации инактивации – уменьшение температуры и pH. Дополнительно проведено количественное снятие Z-группы с Z-L-Ala. Показано, что эффективность Z-деблокирования дипептидов сравнима с отдельными аминокислотами. Изучено влияние бензилового спирта на скорость ферментативной реакции, определена константы ингибирования. Проведен анализ литературы для определения целесообразности ферментативного снятия Z- защитной группы по сравнению с традиционным химическим. Написана статья «Специфичность пенициллинацилаз в реакциях снятия бензилоксикарбонильной защитной группы в аминокислотах» и отправлена в редакцию журнала Acta Naturae. 2. Изучена специфичность и реакционная способность пенициллинацилазы Alcaligenes f. в ацилировании D- аминокислот, фосфоновых и фосфиновых аналогов L-аминокислот. Произведена оценка эффективности использования пенициллинацилаз из Alcaligenes f. и E. сoli в реакции ацилирования D-Ala, D-Trp, D-Phe, D-Leu амидом миндальной кислоты. Изучено влияние ацильного донора на скорость и эффективность ацильного переноса на D-Ala. Установлено, что реакционная способность D-аминокислот и фосфоновых аналогов L-аминокислот примерно на 3 порядка ниже, по сравнению с α-L-аминокислотами. Показана возможность синтеза пептидомиметиков на основе фосфинового аналога L-Ala с помощью пенициллинацилазы. 3. Разработаны 3 новых хемоэнзиматических методики синтеза пептидомиметиков, представляющих возможность относительно легкой замены аминогруппы широкого спектра аминосоединений с помощью пенициллинацилазы из Alcaligenes f. и последующих несложных химических манипуляций в водной среде на физиологически активные радикалы - ацетил, сульфоацетил, тиоацетил. На первой стадии ферментативно с выходом 91% получен N-хлорацетил-L-фенилаланин. На второй стадии по реакции N-хлорацетил-L-фенилаланина с Zn/HCl (25°C) получен N-ацетилфенилаланин, по реакции с сульфитом Na2SO3 (25°C) получен N-сульфоацетилфенилаланин, по реакции с тиосульфатом Na2S2O3 (65°C) и последующим гидролизом соли Бунте с Zn/HCl (25°C) получен N-тиоацетилфенилаланин. Условия реакций были оптимизированы, что обеспечило количественный выход практически во всех случаях. Оригинальность состоит в том, что все три методики от начала и до конца проходят в водной или водно-спиртовой смеси, что особенно актуально, принимая во внимания неуклонно растущие требования фармокопеи. Новизна состоит в том, что до сих пор был описана только лишь одна хемоэнзиматическая методика с использованием пенициллинацилазы (Zhang, 2016), где вторая стадия осуществима лишь при использовании органического растворителя (СH2Cl2). | ||
3 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Использование пенициллинацилазы для стереоселективного синтеза пептидов и пептидомиметиков |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".