Использование пенициллинацилазы для стереоселективного синтеза пептидов и пептидомиметиковНИР

Stereoselective enzymatic synthesis of peptides and peptidomimetics by penicillinacylase

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 21 апреля 2017 г.-1 декабря 2018 г. Использование пенициллинацилазы для стереоселективного синтеза пептидов и пептидомиметиков
Результаты этапа: 1. Разработан метод стереоселективного ферментативного синтеза производных цистеина и глутатиона без использования защитных групп Показано, что ферментативное ацилирование цистеина протекает весьма эффективно, исключительно по аминогруппе. Наибольшая скорость синтеза достигается при использовании фенилацетамида и амидов R-миндальной кислоты и R-фенилглицина. Высокий выход целевого продукта (75-89%) обеспечивается достаточно высоким отношением начальных скоростей синтеза и гидролиза (S/H). Для неспецифических амидов феноксиуксусной и S-миндальной кислоты - при общем замедлении реакции наблюдается увеличение эффективности ацильного переноса (S/H) и, как следствие, выхода продукта ацилирования (до 95%). В отличие от случая с цистеином, в следствие значительного снижения отношения S/Н, ацильный перенос на глутатион менее эффективен. Выход целевого продукта составляет 65-80%. Однако, рассмотренные реакции протекают очень быстро, быстрее чем ферментативный гидролиз природных субстратов с такими же ацильными донорами. 2. Проведен препаративный синтез N-ацильных производных цистеина и глутатиона. Для N-фенилацетил-глутатиона выход составил 65%, для N-феноксиацетил-L-цистеина – 95%, для N-(R)-манделил-(S)-цистеина – 85%). Все синтезированные тиолы характеризовались высокой химической и оптической чистотой (ee>99,9%) 3. Разработаны методики слежения за протеканием биокаталитического синтеза, выделения и очистки целевых соединений, энантиомерной чистотой получаемых продуктов. Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили с помощью обращенно-фазовой хроматографии (ВЭЖХ). Разделение проводили элюированием водно-ацетонитрильной смесью (pH3) с добавлением ион-парного реагента (додецилсульфат натрия) на колонках с С18-фазой. Продукт выделяли осаждением при подкислении реакционной смеси и очищали перекристаллизацией за счет растворения в щелочном буфере или органическом растворителе (см.табл.й). Оптическую чистоту определяли с помощью оригинальной методики, разработанной в лаборатории [Guranda, 2005], которая состояла в предварительной модификации свободных аминогрупп о-фталевым альдегидом и хиральным тиолом. В качестве тиолсодержащего соединения использовали N-ацетил-S-цистеин. 4. Была изучена кинетика избирательного ферментативного ацилирования аминогруппы цистеина различными ацильными донорами без предварительной защиты сульфгидрильной группы. Для увеличения скорости реакции представляется оптимальным использовать «быстрые» доноры (фенилацетамида, амиды R-миндальной кислоты и R-фенилглицина) и повышенные температуры. Для увеличения выхода представляется оптимальным использовать «производительные» доноры (амиды феноксиуксусной и S-миндальной кислоты), высокие концентрации реагентов, избыток ацильного донора, повышенные температуры, рациональный выбор pH на базе «субстратной инженерии». При этом предварительной защиты SH-группы не требуется. Показана принципиальная возможность переноса на цистеин Z-группы и «промежуточного» бромацильного радикала. Однако, требуется учитывать инактивацию фермента в присутствии данных субстратов. При использовании бромацильного радикала необходимо дополнительно защищать SH-группу. 5. В качестве катализатора были использованы препараты пенициллинацилазы дикого типа и мутантный препарат фермента по остатку b484, полученный в результате рационального дизайна и обладающий более высокой стабильностью в щелочной среде и устойчивостью в концентрированных растворах реагентов. Нами было показано, что введение всего лишь одной мутации bD484N увеличивает стабильность фермента в присутствии 200мМ амида R-фенилглицина в 7 раз при pH9.5. Изменения каталитических свойств при этом не наблюдается. Было изучено влияние субстратов и строения используемых ацильных доноров на операционную стабильность ферментных препаратов. Нами было обнаружено, что как при увеличении гидрофобности ацильного донора (Phe>ФГ), так и при увеличении pH наблюдается падение операционной стабильности фермента. В то же время для разных стереоизомеров не наблюдается сколько-нибудь существенных отличий в инактивации фермента. 6. Были выявлены оптимальные условия (выбор ацильного донора, биокатализатора, концентрации субстратов, фермента, рН среды, температура) для проведения препаративного ферментативного синтеза ингибиторов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Было показано,что одной из главных точек оптимизации, является «субстратная инженерия». Для синтеза ингибиторов есть возможность выбрать более «быстрый», «производительный», «стереоселективный», а также «промежуточный донор». Также было показано, что выход реакции увеличивается при повышении концентраций обоих субстратов, а также при избытке донора ацильной части Однако, высокие концентрации некоторых субстратов приводят к тому, что фермент из E.coli быстро теряет свою операционную стабильность. Этого частично удается избежать при использовании стабилизированных препаратов фермента (мутант ПА E.coli по позициям bD484N). Оптимизацию pH следует проводить с тех позиций, что высокие pH (10-10,5), с одной стороны, наиболее оптимальны для ацильного переноса на аминогруппу, а с другой стороны, следует выбирать такое значение pH, при котором наблюдается высокая растворимость исходных реагентов и низкая растворимость продукта переноса (зависит от ацильного донора). Также необходимо учитывать, что природный фермент из E.coli обладает значительно пониженной стабильностью в области высоких pH, по сравнению с ферментом из Alcaligenes f. и необходимо использовать стабилизированную мутантную (bD484N) 7. Было проведено выделение и очистка ферментных препаратов, с помощью техники осмотического шока в градиенте сахарозы (от 20% до 0%) и последующих стадиях очистки в градиенте сульфата аммония (фракция от 1,5М до 2,9М). Проведена иммобилизация фермента и выбрана оптимальная форма биокатализатора для проведения препаративного синтеза N-ацильных производных цистеина. Показано, что иммобилизация не оказывает существенного влияния на кинетические свойства фермента ПА Alcaligenes f. 8. Была изучена специфичность фермента к ацильным донорам (фенилацетамиду, феноксиацетамиду, фенилглицинамиду, п-гидроксифенилацетамиду), зависимость стереоселективности фермента к нуклеофилу и способности к ацильному переносу от природы ацильного донора. Определены значения кинетических параметров, характеризующих эффективность и стереоселективность ферментативного ацильного переноса, и проведен анализ их зависимости от природы донора ацильной части. Обнаружено, что при использовании «производительного» феноксиацетамида увеличивается эффективность ферментативного ацилирования (параметры α и β), а стереоселективность выше в случае амидов R-фенилглицина и R-миндальной кислоты. Наиболее «быстрым» является природный фенилацетамид. Таким образом, как стереоселективность к нуклеофилу, так и эффективность ферментативного ацильного переноса зависят от структуры ацильного донора и поэтому очень важен выбор оптимального ацильного донора при проведении препаративных реакций. Дополнительно нами была показана возможность использования бромацетамида в качестве «промежуточного донора», однако вследствие необратимой инактивации необходимо проводить синтез при пониженных температурах (4°C). 9. Были исследованы возможности ферментативного введения и снятия защитных групп (бензилоксикарбонильной, феноксиацетильной, фенилацетильной, фенилглицильной) в пептидном синтезе. Проверена возможность снятия Z-защиты с ряда L-аминокислот с помощью пенициллинацилаз из Escherichia.coli и Alcaligenes.f. Показано, что Z-L-Ala является наилучшим субстратом. Для фермента из E.coli наблюдали более высокую каталитическую константу, но в то же более слабое связывание. Была исследована возможность ацильного переноса Z-группы с Z-L-Ala как наилучшего субстрата на нуклеофил глицин и фенилглицин. Показано, что уже при низких концентрациях процесс проходит достаточно эффективно, однако существенный вклад вносит неожиданно обнаруженная инактивация фермента.(*) 10. Были исследованы возможности ферментативного синтеза пептидомиметиков – производных неприродных аминокислот, аминоспиртов и первичных аминов . Показано, что ПА A.faecalis является эффективным катализатором ацилирования аминов и аминоспиртов в водных растворах. Для фенилэтиламина и фенилглицинола ферментативное ацилирование является энантиоселективным и может быть использовано для препаративного получения индивидуальных энантиомеров. Установлено, что в рассматриваемом ряду аминосоединений амин является более активным и эффективным (S/H) нуклеофилом, чем аминоспирт. А для стереоселективности зависимость обратная. Показано, что стереоселективность очень сильно зависит от пространственной организации молекулы (**). Было установлено, что при ацилировании аминов и аминоспиртов, в отличие от аминокислот, соотношение (S/H)0 строго линейно возрастает с увеличением концентрации нуклеофила. Что говорит об остсутствии влияния параметра γ (***). Введение мутаций ПА E.coli по позиции bF71L позволяет добиться существенного увеличения энантиоселективности, скорости и эффективности ацилирования фенилаланинола. Введение мутации bF71A приводит к увеличению стереоселективности для данного соединения в 250 раз! (****) * Неожиданно нами было обнаружена инактивация фермента в присутствии Z-L-Ala. В дальнейшем нами было установлено, что инактивация фермента Z-L-аминокислотами pH-зависимая и наиболее проявляется в щелочных условиях. С помощью масс-спектрометрии мы доказали ее необратимый и ковалентный характер. На наш взгляд, детальное изучение механизма столь необычного ингибирования заслуживает дополнительного экспериментального и теоретического изучения (математическое моделирование кинетики процесса) ** Удивительно, но зависимость эта настолько тонкая, что различие всего лишь в одном метильном радикале может привести к увеличению стереоселективности на 3 порядка! *** В свете этого наблюдения, было бы нтересно выяснить, что на самом деле скрывает в себе параметр γ? На наш взгляд стоило бы экспериментально проверить гипотезу связывания второй молекулы нуклеофилоа-кислоты с одним из положительных заряженных радикалов активного центра фермента. **** Для нас было неожиданно, что эффект от одной лишь мутации может привести к увеличению стереоселективности на 2 порядка! Это позволяет проводить реакцию непосредственно из рацемата и выделять оптически чистый продукт с большим энантиомерным избытком (99.7%). Столь высокий эффект от столь малого изменения, на наш взгляд, заслуживает подробного изучения как кинетически, там и с привлечением методов молекулярного моделирования (докинг и молекулярная динамика).
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Использование пенициллинацилазы для стереоселективного синтеза пептидов и пептидомиметиков
Результаты этапа: 1. Проведено системное изучение общего механизма реакции трансфера Z-группы, катализируемого пенициллинацилазой и сопровождаемого необратимой инактивацией. Предложена минимальная кинетическая схема, адекватно описывающая кинетику реакции. Детально изучена кинетика инактивации пенициллинацилазы. Определены основные точки минимизации инактивации – уменьшение температуры и pH. Дополнительно проведено количественное снятие Z-группы с Z-L-Ala. Показано, что эффективность Z-деблокирования дипептидов сравнима с отдельными аминокислотами. Изучено влияние бензилового спирта на скорость ферментативной реакции, определена константы ингибирования. Проведен анализ литературы для определения целесообразности ферментативного снятия Z- защитной группы по сравнению с традиционным химическим. Написана статья «Специфичность пенициллинацилаз в реакциях снятия бензилоксикарбонильной защитной группы в аминокислотах» и отправлена в редакцию журнала Acta Naturae. 2. Изучена специфичность и реакционная способность пенициллинацилазы Alcaligenes f. в ацилировании D- аминокислот, фосфоновых и фосфиновых аналогов L-аминокислот. Произведена оценка эффективности использования пенициллинацилаз из Alcaligenes f. и E. сoli в реакции ацилирования D-Ala, D-Trp, D-Phe, D-Leu амидом миндальной кислоты. Изучено влияние ацильного донора на скорость и эффективность ацильного переноса на D-Ala. Установлено, что реакционная способность D-аминокислот и фосфоновых аналогов L-аминокислот примерно на 3 порядка ниже, по сравнению с α-L-аминокислотами. Показана возможность синтеза пептидомиметиков на основе фосфинового аналога L-Ala с помощью пенициллинацилазы. 3. Разработаны 3 новых хемоэнзиматических методики синтеза пептидомиметиков, представляющих возможность относительно легкой замены аминогруппы широкого спектра аминосоединений с помощью пенициллинацилазы из Alcaligenes f. и последующих несложных химических манипуляций в водной среде на физиологически активные радикалы - ацетил, сульфоацетил, тиоацетил. На первой стадии ферментативно с выходом 91% получен N-хлорацетил-L-фенилаланин. На второй стадии по реакции N-хлорацетил-L-фенилаланина с Zn/HCl (25°C) получен N-ацетилфенилаланин, по реакции с сульфитом Na2SO3 (25°C) получен N-сульфоацетилфенилаланин, по реакции с тиосульфатом Na2S2O3 (65°C) и последующим гидролизом соли Бунте с Zn/HCl (25°C) получен N-тиоацетилфенилаланин. Условия реакций были оптимизированы, что обеспечило количественный выход практически во всех случаях. Оригинальность состоит в том, что все три методики от начала и до конца проходят в водной или водно-спиртовой смеси, что особенно актуально, принимая во внимания неуклонно растущие требования фармокопеи. Новизна состоит в том, что до сих пор был описана только лишь одна хемоэнзиматическая методика с использованием пенициллинацилазы (Zhang, 2016), где вторая стадия осуществима лишь при использовании органического растворителя (СH2Cl2).
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Использование пенициллинацилазы для стереоселективного синтеза пептидов и пептидомиметиков
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".