Выявление и молекулярный анализ вирусов плодовых и декоративных культур в РоссииНИР

Detection and molecular characterization of fruit and ornamental crop viruses in Russia

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 15 мая 2023 г.-31 декабря 2023 г. Выявление и молекулярный анализ вирусов плодовых и декоративных культур в России
Результаты этапа: 1. Впервые в России обнаружен cherry virus A (CVA, род Capillovirus, семейство Betaflexiviridae) и секвенирован полный геном этого вируса. Вирусный изолят обнаружен в Никитском ботаническом саду (НБС, Ялта, Республика Крым) при метатранскриптомном анализе симптоматичного гибрида Prunus cerasifera Erch. х P. аrmeniaca c. Shlor Tsiran. Из 21340 парноконцевых прочтений длиной 250 нуклеотидов (нт), полученных при высокопроизводительном секвенировании (high-throughput sequencing, HTS), собран и аннотирован полный геном российского изолята CVA длиной 7426 нт. В геноме идентифицированы две открытые рамки считывания (open reading frame, ORF). ORF1 длиной 7029 нт кодирует полипротеин (2342 аминокислотных остатка, аа), который содержит мотивы метилтрансферазы, хеликазы и РНК-зависимой РНК-полимеразы и, очевидно, представляет собой репликазу вируса. ORF2 находится в другой рамке считывания и кодирует транспортный белок (movement protein, MP). 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности состоят, соответственно, из 100 и 297 нт. Полногеномная последовательность российского изолята CVA депонирована в GenBank под номером OQ865368. Филогенетический анализ всех доступных полногеномных последовательностей показал, что российский изолят группируется с не-вишневыми изолятами CVA из различных регионов мира и в среднем на 99,5% идентичен изолятам, входящим в этот кластер. 2. Впервые в России обнаружен little cherry virus 1 (LChV1, род Velarivirus, семейство Closteroviridae) и секвенирован полный геном этого вируса. Изолят вируса обнаружен в Степном отделении НБС при анализе вирома тригибрида (P. cerasifera Erch. х P. аrmeniaca L.) x P. brigantiaca Vill. Из 27359 прочтений, полученных при HTS, собран и аннотирован полный геном российского изолята LChV1 длиной 16930 нт. В геноме идентифицированы восемь ORF. Перекрывающиеся ORF1a и ORF1b кодировали компоненты репликазы. Остальные ORF были разделены нетранслируемыми участками длиной от 1 до 171 нт. Полногеномная последовательность российского изолята LChV1 депонирована в GenBank под номером OR260412. Филогенетический анализ всех доступных полногеномных последовательностей LChV1 разделил их на 5 кластеров. Российский изолят группировался с греческим изолятом G15_3 из черешни, однако идентичен ему только на 77,3%. 3. Впервые секвенированы полные геномы российских изолятов prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) и prune dwarf virus (PDV) (род Ilarvirus, семейство Bromoviridae), представленные тремя однонитевыми молекулами РНК положительной полярности, каждая из которых инкапсидирована в отдельную вирусную частицу. Два изолята PNRSV обнаружены в Степном отделении НБС при анализе вирома симптоматичных листьев сливы P. domestica c. Cacanska beste, интродуцированной из бывшей Югославии, и тригибрида [(P. cerasifera Erch. х P. аrmeniaca L.) x P. brigantiaca Vill.]. Изолят PDV выявлен в НБС при метатранскриптомном анализе сеянца сливы неизвестного сорта с симптомами вирусной инфекции. Из прочтений, полученных при HTS, собраны и аннотированы все три геномных РНК российского изолята PDV длиной 3341 (РНК1), 2585 (РНК2) и 2124 (РНК3) нт. Четыре ORF кодировали репликазу, РНК-зависимую РНК-полимеразу, МР и белок оболочки вируса (coat protein, CP). Собраны и аннотированы полные геномы двух изолятов PNRSV, структура генома которых была типичной для представителей рода иларвирусов. Полногеномные последовательности российских изолятов PDV и PNRSV были депонированы в GenBank под номерами OQ995020-OQ995022 и OR090897-OR090902, соответственно. Филогенетический анализ всех доступных полноразмерных последовательностей геномных РНК1, РНК2 и РНК3 PDV и PNRSV показал, что они группируются в два (PNRSV) или три (PDV) основных кластера. При этом у некоторых изолятов обоих вирусов РНК1, РНК2 и РНК3 распределены в разные кластеры, что может указывать на их происхождение путем реассортации и/или рекомбинации. 4. Впервые в России обнаружен представитель группы умбра-подобных вирусов (umbra-like viruses, семейство Tombusviridae) и секвенирован его полный геном, состоящий из однонитевой молекулы РНК положительной полярности. Изоляты вируса обнаружены в генофондовой коллекции инжира (Ficus carica) НБС с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в пяти 30-летних деревьях-каприфигах (мужских растениях инжира) сорта Belle Dure c симптомами мозаичной болезни. В ОТ-ПЦР использовали праймеры, специфичные к fig umbra-like virus (FULV), поэтому выявленный в НБС вирус, возможно, принадлежит к этому же виду. В результате метагеномного анализа образцов каприфигов собраны и аннотированы полные геномы пяти российских изолятов FULV длиной 2953-3076 нт, которые были идентичны между собой на 99,4-99,9%. Три ORF были идентифицированы в геномах российских изолятов. ORF2 кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая транслируется в результате сдвига рамки считывания при трансляции ORF1. ORF5 перекрывается с ORF2 и кодирует белок с неизвестной функцией. Полногеномные последовательности российских изолятов FILV были депонированы в GenBank под номерами OR890003-OR890007. Филогенетический анализ всех доступных полногеномных последовательностей умбравирусов и умбра-подобных вирусов показал, что российские изоляты образуют отдельную кладу, сестринскую с кладой изолятов FULV, обнаруженных на инжире на Гавайях. Возможно, российские и гавайские изоляты умбра-подобных вирусов являются разными вирусами или высокодивергентными изолятами FULV. Российские изоляты вируса обнаружены только в каприфигах и не выявлены ни в одном из обследованных деревьев других сортов инжира. В вироме каприфигов обнаружены также прочтения, родственные fig mosaic virus, fig badnavirus 1 и grapevine badnavirus 1. 5. Из прочтений, полученных ранее при HTS тотальной РНК из деревьев вишни (P. cerasus) с симптомами шарки из Татарстана, собраны шесть новых полных геномов plum pox virus (PPV, род Potyvirus, семейство Potyviridae), относящихся к штамму С (PPV-C). Большая ORF кодировала полипротеин длиной 3143 аа. В полипротеине выявлены мотивы, опосредующие передачу вируса тлями (KITC и PTK в белке Hc-Pro и DAG в СР), GDD в NIb (РНК-зависимой РНК-полимеразе), универсальный эпитоп DRDVDAG в СР и все сайты протеолиза для вирусспецифических протеаз P1, Hc-Pro и NIa. Ген СР состоял из 996 нт и кодировал белок длиной 332 аа. Новые геномы были в среднем на 99,0% идентичны между собой и другим изолятам штамма С из России и Беларуси. Новые полногеномные последовательности шести российских изолятов были депонированы в GenBank под номерами OR889997-OR890002. 6. Проведены обследования насаждений косточковых культур в Главном ботаническом саду имени Н.В. Цицина РАН (ГБС) и музее-заповеднике Коломенское (г. Москва) с целью выявления деревьев с признаками вирусной инфекции. В дендрарии ГБС симптомы обнаружены на деревьях сакуры P. sachalinensis и сливы американской P. аmericana, а в коллекции лаборатории культурных растений ГБС - на абрикосе (P. armeniaca) сортов Водолей, Фаворит и Профессор Скворцов, на персике (P. persica) с. Саратовский и черешне (P. avium) с. Ипуть. Из симптоматичных листьев выделена тотальная РНК с помощью метода, основанного на использовании цетилтриметиламмония бромида (CTAB). Выделенная РНК была использована в качестве матрицы для синтеза библиотек кДНК с целью их последующего HTS на платформе Illumina. В парке Коломенское выявлены деревья сливы с симптомами шарки. Симптомы обнаружены как на высоких старых деревьях, так и на молодой поросли. Анализ образцов листьев с помощью иммуноспецифической ОТ-ПЦР с универсальными праймерами подтвердил PPV во всех исследованных образцах. Это первое выявление PPV в ландшафтных парках г. Москвы. 7. При обследовании коллекций пиона (Paeonia spp.) и флокса (Phlox paniculata) в ГБС и Ботаническом саду МГУ (БС) выявлены многочисленные растения с симптомами вирусной инфекции. На пионе типичным симптомом оказалась кольцевая пятнистость, указывающая на возможное заражение вирусом погремковости табака (tobacco rattle virus,TRV, род Tobravirus, семейство Virgaviridae). На флоксе преобладали крапчатость, мозаика и кольцевая пятнистость на листьях, характерные для неповирусов (род Nepovirus, cемейство Secoviridae). Иммуноферментный анализ (ИФА) симптоматичных растений пиона выявил TRV только в одном из 16 протестированных кустов. ИФА неповируса мозаики резухи (arabis mosaic virus, ArMV) в симптоматичных растениях флокса выявил ArMV только в одном из 12 протестированных кустов из коллекции БС. Выделена тотальная РНК из 10 растений пиона и 7 растений флокса с симптомами вирусной инфекции.
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Выявление и молекулярный анализ вирусов плодовых и декоративных культур в России
Результаты этапа: 1. При изучении вирома симптоматичных растений флокса (Phlox spp.) и пиона (Paeonia spp.) с помощью высокопроизводительного секвенирования (high-throughput sequencing, HTS) были собраны контиги, родственные известным вирусам этих декоративных культур. На флоксе выявлены alfalfa mosaic virus (AMV), tobacco rattle virus (TRV), spiranthes mosaic virus 3 (SpiMV3) и arabis mosaic virus (ArMV). Впервые на флоксе обнаружены неповирус beet ringspot virus (BRSV) и иларвирус tobacco streak virus (TSV), что расширяет список известных вирусов этой культуры. На пионе обнаружены Gentian Kobu-sho-associated virus (GKSaV) и сycas necrotic stunt virus (CNSV), а также две формы TRV, одна из которых, типичным для тобравирусов образом, представлена двумя геномными РНК (РНК1 и РНК2), а вторая - только РНК1. Длина контигов и/или их количество потенциально позволяют в ряде образцов собрать полные геномы перечисленных вирусов. 2. Впервые в России обнаружен SpiMV3 (род Potyvirus, семейство Potyviridae) и впервые секвенирован его полный геном. Геном SpiMV3, обнаруженного на растении флокса Ph. paniculata в Ботаническом саду МГУ имени М.В. Ломоносова (БС МГУ), состоит из 9520 нт и организован типичным для потивирусов образом. Большая открытая рамка считывания (open reading frame, ORF) длиной 9258 нуклеотидов (нт) кодирует полипротеин из 3085 аминокислотных (аа) остатков. PIPO +2 ORF начинается внутри консервативного G2A7 мотива (нт 2936-2944) в гене P3 и заканчивается на ближайшем in-frame TAA стоп-кодоне (нт 3185-3187). Большая ORF фланкирована 5'- и 3'-нетранслируемыми последовательностями (untranslated region, UTR) длиной 137 and 125 нт, соответственно. Полная последовательность генома SpiMV3 депонирована в GenBank под номером PQ374234. В полипротеине картированы девять предполагаемых сайтов протеолиза. Методом ОТ-ПЦР с праймерами, разработанными на основе полной последовательности российского изолята SpiMV3, вирус обнаружен еще в восьми сортах флокса из генофондовой коллекции Главного ботанического сада имени Н.В. Цицина РАН (ГБС). 3'-концевые последовательности новых изолятов были определены методом Сэнгера и депонированы в GenBank под номерами PQ464116-PQ464123. Филогенетический анализ гена белка оболочки (БО) SpiMV3 показал, что все российские и зарубежные изоляты собраны в два отдельных кластера со 100%-ной бутстрэп-поддержкой. Кластеризация не зависела ни от географического происхождения изолята, ни от вида растения-хозяина, на котором обнаружен этот вирус, однако российские изоляты группируются в одном кластере. Идентичность последовательностей БО между кластерами составила 72.2% - 75.1% и 82.1% - 84.7% на нт и аа уровнях, соответственно. Учитывая демаркационные критерии вида, принятые для потивирусов (<76% и <82% идентичности на нт и аа уровнях для полных геномов), нельзя исключить, что два кластера образованы не дивергентными изолятами SpiMV3, а разными потивирусами. 2. При изучении вирома черешни (Prunus avium) с. Ипуть с вирусоподобными симптомами морщинистости листьев из коллекции косточковых культур ГБС получены прочтения, родственные капилловирусу cherry virus A (CVA, род Capillovirus, семейство Betaflexiviridae), и собран полный геном нового изолята этого вируса, названного SwC14 (PQ036874). Геном SwC14 содержал две ORF, кодирующих вирусную репликазу, БО и транспортный белок (ТБ). ORF1 длиной 7029 нт кодирует полипротеин из 2342 аа, а ORF2 длиной 1392 нт (нуклеотиды 5440-6831) находится в другой рамке считывания и кодирует ТБ из 463 аа. В полипротеине обнаружены мотивы вирусной метилтрансферазы (нт 43-351), РНК-хеликазы (818-1096), РНК-зависимой РНК-полимеразы (1283-1600) и БО триховирусов (Tricho_coat superfamily, позиции 2178-2335). 5′- и 3′-UTR состояли из 94 и 278 нт, соответственно. Последовательность генома SwC14 наиболее близка ряду канадских изолятов CVA из черешни (идентичность 99,4%) и на 81,4-95,0% идентична изолятам этого вируса из других видов косточковых и других регионов мира, включая охарактеризованный ранее крымский изолят PTC (идентичность 82,0%). В ОТ-ПЦР c разработанными ранее праймерами к изоляту PTC, CVA был также выявлен в шести из семи других обследованных бессимптомных сортов черешни. Секвенирование продуктов ПЦР показало, что изоляты CVA из сортов Юлия, Ревна, Тютчевка, Орловская Янтарная и Бряночка на 99,1–99,6% идентичны соответствующему участку генома SwC14 из сорта Ипуть и, видимо, имеют с этим изолятом общего предка. Изолят из сорта Витязь оказался идентичен SwC14 только на 87,7% и близкородственен австралийским изолятам CVA LV35S1 (LC523012) и TAS12S2 (LC523008) из черешни (идентичность 99,3–99,7%). Частичные последовательности CVA были депонированы в GenBank под номерами PQ117754–PQ117758. Это первое сообщение о находке CVA в Центральной России, что расширяет информацию о географическом распространении и генетическом разнообразии вируса. Обнаружение дивергентных изолятов в географически отдаленных областях России (Крыму и Москве) указывает на возможность существования генетически гетерогенной популяции этого вируса на различных косточковых культурах в Европейской части России. 3. Новый баднавирус найден на крапиве двудомной (Urtica dioica L., семейство Urticaceae) с симптомами окаймления жилок, растущей среди деревьев коллекции косточковых культур ГБС. Вирус обнаружен при изучении вирома симптоматичного растения крапивы и получил название Badnavirus urticae (nettle badnavirus 1, NBV 1). Полный геном NBV 1 представлен одной молекулой двунитевой кольцевой ДНК, состоит из 7598 пар нт, содержит три перекрывающиеся ORF и большой межгенный регион (large intergenic region, LIGR). ORF перекрываются таким образом, что последний аденозин терминирующего TGA (или TAA) кодона является одновременно первым нуклеотидом инициаторного ATG кодона следующей рамки. В LIGR были идентифицированы TATA-бокс (TATATAA, нт 7405-7411) и сигнал полиаденилирования (AATAAA, нт 7486-7491). Ближайшим родственником NBV 1 является green Sichuan pepper vein clearing-associated virus (MK371354). Полные геномы двух вирусов идентичны на 73,9%, а участки генома, кодирующие обратную транскриптазу и РНКазу H - на 76,3%. Этот показатель ниже порогового значения для определения вида в роде Badnavirus (80%). По-видимому, NBV 1 является новым представителем этого рода в семействе Caulimoviridae. Последовательность полного генома NBV 1 была депонирована в GenBank под номером PP792697. Филогенетический анализ полноразмерных геномов баднавирусов показал, что NBV 1 образует общую кладу с баднавирусной последовательностью, интегрированной в геном крапивы (OZ076864, хромосома 6, нт 40912896 - 40920440). Эти две последовательности идентичны на 78%, показывая, что NBV 1 не интегрирован в геном крапивы, а находится в растении в эписомальной форме. Полученные результаты расширяют список известных баднавирусов и вирусов, заражающих крапиву, а также указывают на существование в ГБС природного вирусного очага, образованного зараженными растениями крапивы. 4. Впервые изучены распространенность, штаммовая принадлежность и генетическое разнообразие изолятов вируса оспы сливы (plum pox virus, PPV, род Potyvirus, семейство Potyviridae) в районе Большого Сочи (Краснодарский край). Обследовали насаждения косточковых культур в генофондовой коллекции Субтропического научного центра РАН (СНЦ), Сочинском дендрарии и частных хозяйствах в Дагомысе и Адлере. При осмотре насаждений частных хозяйств выявлены несколько деревьев сливы P. domestica с типичными симптомами шарки на листьях. В дендрарии обнаружено дерево вишни мелкопильчатой (P. serrulata) с симптомами PPV на корневой поросли. В СНЦ при обследовании коллекций персика, сливы и алычи найдено дерево персика с симптомами шарки. Образцы листьев были проанализированы в ELISA с помощью тест-системы SRA 31505 (Agdia) и в иммуноспецифической ОТ-ПЦР с праймерами Р1/P2, выявляющими все известные изоляты вируса, а также с праймерами, специфичными к штаммам D, M, Rec, W, C и CR. Все выявленные изоляты принадлежали к известным штаммам PPV. Сливовые изоляты из Адлера и персиковый изолят из СНЦ относились к штамму D, сливовые изоляты из Дагомыса - к штамму М, а вишневый изолят - к штамму С. Секвенирование филогенетически информативных 3'-концевых последовательностей этих изолятов длиной 1,2 - 1,4 kb, охватывающих С-терминальную часть гена NIb, полностью ген БО и часть 3'-UTR, подтвердило их штаммовую принадлежность, определенную с помощью ОТ-ПЦР. BLASTn анализ показал, что персиковый изолят PPV из СНЦ наиболее близок (98,8% идентичности) крымскому изоляту вируса из нектарина (KR028386). Изоляты PPV-D из Адлера оказались на 99,3% идентичны между собой и канадскому изоляту вируса (LT600780). Все три саженца были завезены из питомника в г. Крымск и, по-видимому, представляют собой вегетативное потомство одного и того же растения, зараженного PPV. Изоляты PPV-M из Дагомыса были на 98,9% и 99,2% идентичны, соответственно, словацкому изоляту вируса из персика (HF585100) и изоляту из Сербии и Черногории (AJ243957). Изолят PPV-C из вишни мелкопильчатой оказался на 98.8% идентичен изоляту Ka7 (MH311857), обнаруженному ранее на вишне (P. cerasus) в Татарстане. Это первое обнаружение PPV на новом хозяине - вишне цветущей (сакуре) (P. serrulata). Сравнение 3'-концевых последовательностей сочинских изолятов PPV и депонированных в GenBank четко показало, что выявленные изоляты проникли в регион с зараженным посадочным материалом. Частичные последовательности генома сочинских изолятов PPV депонированы в GenBank под номерами PQ563230-PQ563236.
3 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Выявление и молекулярный анализ вирусов плодовых и декоративных культур в России
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен
1. Soglashenie.pdf Soglashenie.pdf 278,5 КБ 29 мая 2023 [Chirkov]