ИСТИНА

Ключевые аспекты функционирования нейронов регулируются за счет действия сигнальных механизмов, в основе которых лежат изменения концентрации внутриклеточного кальция. Различные по своей интенсивности и продолжительности, эти изменения активируют множество сигнальных путей, приводящих к конкретным физиологическим эффектам. Разнообразие событий, регулируемых ионами кальция, обеспечивается за счет действия нейрональных кальциевых сенсоров (НКС) – семейства Са2+-связывающих белков, способных в ответ на связывание катиона модулировать активность эффекторных белков, тем самым, преобразуя сигналы кальция в широкий спектр клеточных ответов. Несмотря на высокую степень гомологии и структурного сходства внутри этого семейства, каждый НКС реагирует на изменения концентрации внутриклеточного кальция в конкретном узком диапазоне и способен высокоспецифично распознавать и регулировать свойственные именно для него белки-мишени. Структурные механизмы, которые обеспечивают такую уникальность функциональных свойств отдельных НКС, в большинстве своем, до сих пор остаются неизвестными. Более того, обнаружение все более новых мишеней для НКС расширяет и усложняет понимание этих механизмов. Подход к решению этой проблемы был предложен в нашей работе (РФФИ 09-04-00666), в рамках которой для одного из НКС, фоторецепторного белка рековерина, был сформулирован новый механизм настройки регуляторной активности с участием “С-концевого сегмента” – вариабельной в пределах семейства НКС регуляторной последовательности, обеспечивающей индивидуальные функциональные свойства белка (Zernii et al. Biochem. J. 2011, 435:441-50). Мы предполагаем, что регуляторная функция вариабельного С-концевого сегмента может оказаться универсальным свойством белков этого семейства. Кроме того, по нашим предварительным данным, с учетом специальных условий, возникающих внутри клетки, возможны и другие механизмы индивидуальной настройки функционирования отдельных НКС, включающие связывание ими дополнительных катионов,окислительные модификации и димеризацию этих белков, изменение их внутриклеточной локализации, взаимодействие со вспомогательными белками. Исходя из этого, цель настоящего проекта – комплексное исследование механизмов, лежащих в основе регуляции функциональной активности отдельных НКС в условиях, моделирующих различные состояния, возникающие внутри клетки. В рамках проекта, с использованием имеющихся в нашем распоряжении генетических конструкций для получения нескольких НКС (рековерина, белков активаторов гуанилатциклазы и нейрокальцина), а также универсального кальциевого сенсора кальмодулина планируется решение следующих задач. 1. Изучение влияния структуры вариабельного С-концевого сегмента НКС на индивидуальные функциональные способности этих белков. 2. Изучение механизма настройки регуляторной активности НКС в присутствии различных концентраций ионов кальция и магния. 3. Исследование влияния окислительных модификаций НКС по консервативному остатку цистеина, в том числе, димеризации НКС с образованием дисульфидной связи, на функционирование этих белков. 4. Исследование механизма регуляции функционирования НКС за счет взаимодействия с каркасным белком из рафт-структур кавеолином-1. Проект имеет особую актуальность, поскольку его результаты позволят не только внести вклад в установление фундаментальных основ Са2+-зависимой регуляции нейрональной функции в норме, но и откроют новые перспективы для понимания молекулярных механизмов развития целого ряда неврологических заболеваний, в патогенезе которых ключевую роль играют нарушения функционирования НКС.

Проект направлен на установление общих принципов функционирования белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров (НКС). В рамках Проекта на примере фоторецепторных НКС рековерина (REC), белка активатора гуанилатциклазы 2 (GCAP2) и нейронального кальциевого сенсора 1 (NCS1) установлены механизмы, определяющие специфику регуляторной активности структурно-сходных белков семейства, предотвращая конкуренцию между ними и обеспечивая широкий спектр опосредуемых ими клеточных эффектов. (1) Проведено сравнение специфичности действия НКС, в зависимости от условий внутриклеточной среды. Установлено, что для фоторецепторных НКС характерна разная степень селективности в отношении ферментов-мишеней каскада фототрансдукции – гуанилатциклазы E (GC-E) и родопсинкиназы (RK). В то время как способностью модулировать GC-E обладает только GCAP2, активность RK in vitro ингибируется всеми тремя белками, причем эффективность их связывания с ферментом и действия на его активность убывает в ряду REC>NCS1>>GCAP2. Выявлены различия в механизмах и условиях взаимодействия этих белков с фоторецепторными мембранами. Так, REC и NCS1 связываются с мембранами за счет N-концевой миристоильной группы (т.н. Са2+-миристоильного переключателя), при этом в первом случае взаимодействие является Са2+-зависимым и обратимым, а во втором – менее чувствительным к Са2+ и необратимым. Связывание GCAP2 с мембранами не зависит от миристоильной группы и присутствия Са2+, однако контролируется за счет фосфорилирования белка под действием циклонуклеотидзависимых протеинкиназ. Аффинность REC и GCAP2 к фоторецепторным мембранам определятся также гетерогенностью состава последних, в частности, наличием в них устойчивых к детергентам микродоменов, т.н. рафт-структур. Установлено, что НКС обладают разной чувствительностью к изменениям редокс-потенциала внутриклеточной среды. REC и NCS1 способны окисляться in vitro с образованием дисульфидных димеров (dRс и dNCS1) или окисленных мономеров (характерно для REC). REC димеризуется преимущественно в Са2+-связанной форме, NCS1 – в бескальциевой форме, в то время как окисление GCAP2 приводит к интенсивной мультимеризации белка и происходит вне зависимости от Са2+. В случае REC окисление приводит к нарушению структуры белка, а также к подавлению его мембранной ассоциации и регуляторной активности в отношении RK. Показано, что окисление REC происходит ex vivo и in vivo – в условиях светоиндуцируемого окислительного стресса. При этом образуются dREC, дисульфидные мультимеры/агрегаты REC, а также его смешанные дисульфидные формы, содержащие тубулин и некоторые другие белки. Накопление таких REC-содержащих форм ассоциировано с дегенерацией фоторецепторных клеток. Определено значение редокс-потенциала пары dREC/REC in vitro, на основе которого проведена оценка светозависимых изменений редокс-потенциала в цитоплазме фоторецепторной клетки. (2) Установлена взаимосвязь между функциональной специфичностью НКС, и их структурной организацией. С использованием белково-инженерного подхода показано, что селективность действия REC, GCAP2 и, в некоторой степени, NCS1 в отношении ферментов-мишеней регулируется при участии их С-конецвого сегмента – вариабельного среди НКС мотива, структура которого определяет доступность и сродство участков связывания мишеней в молекуле белка. С-конецвой сегмент GCAP2 дополнительно вовлечен во взаимодействие белка с мембранами и содержит сайт фосфорилирования, за счет которого обеспечивается чувствительность мембранной локализации GCAP2 к действию сигнальных протеинкиназ. В случае NCS1 С-конецвой сегмент модулирует Са2+-миристоильный переключатель, блокируя обратный захват миристоильной группы при диссоциации Са2+ и, тем самым, обеспечивая необратимость мембранной локализации белка. Способность НКС взаимодействовать с мембранными рафтами в значительной степени обусловлена присутствием в этих белках потенциального сайта связывания кавеолина-1 (Сav1) – основного интегрального компонента рафт-структур. Так, REC и GCAP2 образуют комплекс с ответным участком цитоплазматического домена Cav1, что не оказывает влияния на регуляторную активность этих НКС, но способствует их мембранной ассоциации. Кроме того, в случае REC взаимодействие с Cav1 повышает исходно низкое сродство белка к Са2+, что может способствовать адаптации его Cа2+-чувствительности к физиологическому диапазону концентрации катиона. Специфика редокс-чувствительности НКС определяется положением в молекуле каждого из этих белков консервативного остатка цистеина (C39 в REC, С35 в GCAP2, С38 в NCS1). C39 в REC и С38 в NCS1, являясь единственными остатками такого типа, располагаются на поверхности, соответственно, Са2+-связанной и бескальциевой форм этих белков, что согласуется с преимущественным окислением именно этих форм. В отличие от REC и NCS1, GCAP2 содержит три поверхностных остатка цистеина (включая С35), что может лежать в основе более выраженной и Са2+-независимой реакции этого белка на повышение окислительно-восстановительного потенциала среды. Таким образом, описанные структурные механизмы обуславливают функциональное разнообразие НКС, определяя различную чувствительность этих белков к прямым (изменение концентрации Са2+, редокс-статуса среды) и опосредованным (фосфорилирование под действием сигнальных протеинкиназ) сигналам, а также обеспечивая компартментализацию с мишенями (цитоплазматическая/мембранная локализация, локализация в мембранных рафтах) и селективность их узнавания. Результаты Проекта имеют важное прикладное значение, поскольку впервые указывают на участие НКС в патологических процессах в сетчатке, связанных с окислительным стрессом, а также позволяют сформулировать возможные подходы к селективному подавлению аберрантной активности NCS1, ассоциированной с заболеваниями ЦНС.