| Результаты этапа: Выполнение первой задачи 2017 года по разработке синтетичесских подходов получения наноматериалов и нанокомпозитов с оптимально подобранными функциональным параметрами и биосовместимостью осуществлено путем использования оригинальных методов синтеза и направленной химической модификации наночастиц с размерами 10 – 50 нм, нанокомпозитов на основе микрочастиц – носителей, в том числе, микроцеллюлозы, микросфер диоксида кремния, полученных методом Штобера, пористых микрочастиц - псевдоморфов сложной формы, а также консолидированных наноструктур на основе благородных металлов, включая иерархически структурированные островковые пленки металического серебра, полученные пиролизом аэрозоля. При этом достаточно большое внимание было уделено отработке методик нанесения вспомогательных слоев хитозана как биосовместимого полифункционального полимера, способствующего иммобилизации наночастиц, предконцентрированию и захвату аналитов.
Методики получения наноматериалов включали в себя подходы «мокрой химии» и методы химической гомогенизации для получения образцов на основе металлического серебра. Физические методы получения наноструктур не были использованы, так как наш предыдущий опыт показал, что такие образцы, как правило, мало устойчивы при хранении в присутствии кислорода и азота воздуха. Для обеспечения бОльшей биосовместимости и достижения максимальной чистоты наноматериалов в отношении побочных продуктов химического синтеза применялись диаммиакаты гидроксида серебра в виде водных растворов, для восстановления которых до наноструктур металлического серебра использовали перекись водорода или процессы термического неравновесного разложения в процессе пиролиза аэрозолей, которые приводили к иерархически структурированным островковым пленкам металического серебра c оптимальными функциональным параметрами – широкой полосой плазмонного резонанса в районе длин волн часто используемых лазеров, 514 – 532 нм, 633 нм, 785 нм. Биосовместимость полученных ГКР – активных слоев повышали за счет нанесения биопротектирующих покрытий, в том числе из тонких слоев набухающих гелей, в качестве основного компонента для которых использовали хитозан.
Вторая задача 2017 года по комплексной характеризации полученных материалов с использованием современных инструментальных методов анализа была выполнена за счет использования оборудования Центра коллективного пользования ФНМ МГУ “Технологии получения новых наноструктурированных материалов и их комплексное исследование” (http://www.fnm.msu.ru/nauchnaya-rabota/tsentr-kollektivnogo-polzovaniya). Для определения физико – химических, структурных и морфологических особенностей полученных материалов, а также их функциональных характеристик применяли оптическую микроскопию в поляризованном свете (анализ общего вида и толщины слоев ГКР – активных чипов), растровую электронную микроскопию с локальным рентгеноспектральным микроанализом (морфологические особенности и анализ химического состава), просвечивающую электронную микроскопию с электронной дифракцией выбранной области (анализ структуры и микроструктуры), рентгенофазовый анализ (анализ фазовой частоты и размеров областей когерентного рассеяния наноматериалов), спектроскопию в ультрафиолетовой и видимой области, в том числе в режимах зеркального отражения и/или диффузного рассеяния (анализ положения полос плазмонного резонанса и эффективности поглощения излучения наноструктурами), спектроскопию комбинационного рассеяния (анализ колебательных спектров компонентов материалов, биополимеров, биологических объектов, а также спектральных особенностей и коэффициентов усиления КР – спектров аналитов в присуствии плазмонных наноструктур). Контроль функциональных характеристик, включая положение и интенсивность мод плазмонного резонанса, осуществляли за счет изменения морфологических характеристик и иерархической структуры плазмонных структур с различной предысторией получения. Высокое сродство поверхности наноматериалов по отношению к целевым аналитам достигали путем модифицирования хитозаном. Для увеличения коэффициентов усиления оптические свойства наноструктур подстраивали под возбуждающее лазерное излучение (зеленый и красный лазеры) и полосы поглощения анализируемых молекул. Во всех конечных экспериментах по спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния максимально уменьшали мощность возбуждающего излучения (типично – до 5 – 10% от номинального) для предотвращения фотоповреждения анализируемых биологических объектов.
Решение третьей задачи 2017 года было необходимо для обеспечения последующих экспериментов новым типом ГКР – активных элементов, которые можно получать достаточно масштабируемо, воспроизводимо и которые требуют для анализа минимальное количество жидких аналитов (растворов, в том числе тех, которые содержали биологические объекты для анализа). Попытки использовать в качестве подложек для разделения сложных смесей аналитов различные варианты бумажных и оксидных носителей для тонкослойной хроматографии, покрытых слоем наночастиц серебра или других благородных металлов, не были достаточно успешными, поскольку такие системы требуют достаточно большие количества анализируемых веществ, а также обладают излишне высокой емкостью по поглощаемым в порах наночастицам. Дополнительным недостатком таких систем явилось также наличие высокой открытой поверхности, что приводит к быстрому испарению подвижной фазы – носителя или специального буферного раствора с заданной осмолярностью, который необходим для обеспечения сохранности живых клеток или клеточных органел. Наконец, при локальности анализа в несколько микрон, что может быть достигнуто при использовании рамановского микроскопа, имевшегося в наличии (Renishau Inviva), высокая шероховатость поверхности коммерчески доступных материалов для тонкослойной хроматографии не позволяла добиться комфортной фокусировки пятна возбуждающего лазерного излучения. При последующем анализе для ряда марок (силуфол, алуфол) был обнаружен высокий уровень люминесценции при ГКР, что связано, по всей видимости, с наличием недокументируемых добавок органических связующих или запатентованных модификаторов поверхности, которые вводятся при производстве данных материалов для тонкослойной хроматографии.
В силу указанных причин в проекте предложен способ создания «микрохроматографических колонок», сочетающих возможности предконцентрирования и пространственного перераспределения низко- и высокомолекулярных биологически активных аналитов по анализируемой зоне за счет использования сорбирующих пористых носителей, наноструктур для усиления КР - спектров аналитов и гелирующихся сред. В типичном эксперименте по стандартному методу Штобера (щелочной гидролиз тетраэтоксисиликата) получали суспензию микросфер диоксида кремния, в которую добавляли заранее подготовленный 1 - 2 % водный раствор гидроксиэтилцеллюлозы или хитозана до его общей концентрации 0.2 – 0.4% в конечной суспензии. В ряде случаев в полученную стабилизированную суспензию вводили в качестве внутреннего ГКР – эталона спиртовый расвтор люминесцентного красителя (Родамин 6Ж) в концентрации не выше 0.1 нМ. Полученную суспензию перемешивали в течение 15 – 20 минут на магнитной мешалке при комнатной температуре и вводили 15 - 20 об.% спиртовой суспензии наночастиц серебра, представлявших собой псевдоморфы октаэдрической формы, полученные восстановлением оксида серебра (I) пероксидом водорода в присутствии водного аммиака и поливинилпирролидона как стабилизатора и поверхностно – активного вещества. После дополнительного перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 минут для гомогенного распределения октаэдров многокомпонентную суспензию использовали непосредственно сразу после приготовления для заполнения тонкостенных стеклянных гематокритных медицинских капилляров (Virtex, Дания) на пятую часть длины. После заполнения капилляры втыкали в слой парафина толщиной около 2 мм в пластиковой чашке Петри и помещали в лабораторный сублиматор (типа Labconco Freezone). При понижении давления до рабочего суспензия в капиллярах теряла большую часть растворителя, «вскипала» с загустеванием и тем самым перераспределялась на всю длину капилляров, формируя пористую структуру из микросфер диоксида кремния, ГКР – активных наночастиц и связующего (клея) в виде хитозана или гидроксиэтилцеллюлозы, которые в дальнейшем выступали в качестве «жертвенного» набухающего биосовместимого полимера, концентрирующего аналит. Диоксид кремния выступал, в основном, в качестве инертного наполнителя. После охлаждения до – 45 – 50 0С и последующей сублимационной сушки в течение 1 – 3 дней получали карилляры, заполненные изнутри сухим пористым связным материалом для осуществления смешанного (на открытой в порах поверхности микросфер диоксида кремния и по прослойкам гелирующегося полимера) пространственного хроматографического разделения компонентов анализаруемых смесей с одновременным ГКР – анализом за счет однородного распределения внутри капилляра и в контакте с внутренней поверхностью стекла наночастиц серебра. Подобная конструкция обеспечивает более длительное хранение наночастиц из – за ограниченного доступа воздуха и влаги, а также возможность анализа аналитов в тонком слое жидкости (геля) из – за малого диаметра капилляра и предотвращения испарения растворителя. В результате достигается также лучшая воспроизводимоcсть сигнала гигантского комбинационного рассеяния, интенсивность и характеристические особенности которого изменяются для аналитов в смеси за счет их хроматографического разделения и предконцентрирования в геле из исходной подвижной фазы.
Актуальность аналитических результатов первого этапа проекта обусловлена современными требованиями по развитию новых методов медицинской экспресс – диагностики, оперирующими с небольшими количествами биоматериала (вплоть до единичных клеток, органелл или биомолекул) и не требующими высокой продолжительности или стоимости анализа, в том числе для скрининга населения и выявления различных социально – значимых заболеваний или, с другой стороны, детального неразрушающего анализа биологических объектов в интересах персональной медицины. |
