Разработка базовых принципов антиишемической стратегииНИР

The development of the basic principles of anti-ischemic strategy

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 28 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. Разработка базовых принципов антиишемической стратегии
Результаты этапа: Показано, что ацетилирование ядерных белков является маркером естественного и преждевременного старения. Изменение аутофагии/митофагии с соответствующим изменением ферментов, принимающих участие в митофагии также отмечается в почке старых животынх и на моделях преждевременного старения. Сделана оценка возможных функций (кроме энергетической) митохондриального мембранного потенциала и даны рекомендации по правильной оценке мембранного потенциала
2 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. Разработка базовых принципов антиишемической стратегии
Результаты этапа: Используя крыс линии OXYS, имеющих признаки преждевременного старения, был изучен нефропротекторный эффект ограничения калорийности рациона и ишемического прекондиционирования на острую почечную недостаточность, вызванную ишемическим воздействием со сравнением этих эффектов у нормальных беспородных животных. Ишемия почки приводила к повышению в крови продуктов азотистого обмена (кретианина и мочевины). Уменьшение потребляемой пищи для обоих групп животных в течение 4 недель приводило к более чем двукратному снижению креатинина у ишемизированных животных. Это доказывает, что ограничение по питанию обладает мощным нефропротекторным потенциалом и способно уменьшать тяжесть повреждения почки даже у крыс с возрастными изменениями в почечной ткани. Была оценена эффективность ишемического прекондиционирования для предотвращения ишемических последствий, и было отмечено, что в то время как у молодых беспородных животных ишемическая тренировка приводит к снижению почечной недостаточности, у крыс, несущих старческий фенотип, таких защитных функций не отмечалось. Для объяснения отсутствия защитного эффекта ишемической тренировки мы проанализировали компоненты лизосомально-аутофагосомальной системы. Анализ показал, что ишемизация ткани нормальных животных приводит к активации системы аутофагии, явно вызванной повреждением. При этом ишемическое прекондиционирование в почке беспородных крыс уменьшает активность лизосом, но не уменьшает ее в почках крыс OXYS, при этом содержание маркеров аутофагии, например, beclin-1, остается таким же, как и у молодых беспородных крыс, однако, содержание изоформ белка LC3 отличается. Было показано, что снижается как уровень LC3 I, так и LC3 II, что может свидетельствовать об уменьшении в клетках почечной ткани компонентов системы аутофагии, что характерно для тканей стареющего организма. Уровень белка PINK-1 во фракции митохондрий также оказался выше у крыс линии OXYS, что может свидетельствовать о нарушениях в работе системы ауто/митофагии. Таким образом, мы показали, что ишемическое прекондиционирование не обладает значимым нефропротекторным потенциалом для защиты старого организма, в отличие от ограничения питания, которое значительно уменьшает тяжесть почечного повреждения у преждевременно стареющих крыс линии OXYS. Исследование влияния клеточных технологий на почечное повреждение показало, что репаративный и пролиферативный потенциал мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток (ММСК) из костного мозга животных, равно как и уровень продукции этими клетками активных форм кислорода (АФК) в их митохондриях, заметно снижается с возрастом. Это указывает на возможность повреждения митохондрий стволовых клеток по мере их старения, или может свидетельствовать о накоплении поврежденных митохондрий в результате неэффективной работы системы удаления поврежденных органелл в результате дисфункции системы контроля качества митохондрий. Обнаруженная аккумуляция в ММСК маркера клеточного старения липофусцина напрямую указывает на старение этой клеточной популяции по мере увеличения возраста донора и на неэффективность систем аутофагии и/или протеасомальной деградации поврежденных компонентов клеток. Более выраженное накопление липофусцина наблюдалось при длительном культивировании ММСК, что указывает на развитие феномена клеточного сенесценса in vitro, что совершенно очевидно ограничивает возможности наращивания значительных количеств ММСК для терапевтического использования. Отметив ранее репарирующее влияние транспорта митохондрий между клетками, мы оценили возможность межклеточного обмена митохондрий между ММСК от молодых животных и астроцитами, а также вклад межклеточного транспорта митохондрий в терапевтическую эффективность ММСК при ишемии головного мозга. Основываясь на морфологии клеток и частоте перемещения митохондрий, измеренного при помощи разного типа митохондриальных зондов, включая трансфекцию митохондриально-направленным зеленым флуоресцентным белком, мы доказали, что происходит межклеточный транспорт митохондрий из ММСК в нейроны при полном отсутствии переноса в обратном направлении. То же самое наблюдалось при сокультивации ММСК с астроцитами. Мы предположили, что наблюдаемый нами феномен является неотъемлемой частью физиологии ММСК, выработанной эволюционно и, возможно, этот процесс имеет в первую очередь функциональное значение при патологических условиях, например, при ишемическом повреждении органа. Для проверки данной гипотезы мы моделировали условия ишемии in vitro путем подвержения воздействию кислородно-глюкозной депривации (КГД) с последующим сокультивированием с ММСК. В результате КГД происходила фрагментация митохондриальной сети, что указывало на их повреждение. Было обнаружено, что в культуре астроцитов, подвергнутых КГД, при сокультивировании с ММСК значительно увеличивалась популяция астроцитов, получивших митохондрии от ММСК. Таким образом, повреждение митохондрий в результате гипоксии/ишемии в клетках-реципиентах стимулирует транспорт функциональных митохондрий из ММСК. Исходя из этого, мы предположили, что митохондриальная дисфункция запускает определенные механизмы, отвечающие за межклеточную коммуникацию и транспорт митохондрий из окружающих клеток. Проверку данной гипотезы мы проводили на клетках, в митохондриях которых отсутствует или повреждена мтДНК. Сокультивирование ρ0 РС12 клеток с ММСК приводило к значительному росту популяции клеток, получивших митохондрии от ММСК, по сравнению с сокультивированием ММСК с нативными клетками РС12. Важный функциональный результат транспорта митохондрий из ММСК заключался в восстановлении митохондриальных функций клеток-реципиентов, что было видно по уменьшению генерации ими лактата в клетках и повышении их пролиферирующей активности. Сокультивирование ММСК, имеющих повышенную экспрессию моторного белка, ответственного за внутриклеточный транспорт митохондрий (Miro1), с первичной культурой астроцитов приводило к увеличению межклеточного транспорта митохондрий от ММСК к астроцитам, и при трансплантации таких Miro1-ММСК животным с экспериментальным инсультом, их нейропротекторный эффект был выше по сравнению с нативными ММСК, о чем говорил целый ряд неврологических тестов, проведенных с этими животными. Мы заключаем, что межклеточный транспорт митохондрий от ММСК к нейральным клеткам играет ключевую роль в проявлении нейропротекторных эффектов ММСК при экспериментальном ишемическом инсульте. При изучении патогенных свойств активных форм кислорода (АФК) при экспериментальном инсульте новорожденных мы обнаружили повышенный вдвое уровень генерации АФК и существенную деполяризацию/деэнергизацию митохондрий, сопровождающую ишемическое повреждение. Инъекция митохондриально-направленного антиоксиданта SkQR1 сразу после окончания гипоксии приводила к снижению неврологического дефицита крысят. Мы заключаем что неонатальная гипоксия-ишемия вызывает дисфункцию митохондрий, которая может быть уменьшена введение митохондриально-направленных антиоксидантов, снижающих объем повреждения мозга и восстанавливающих неврологические функции, что свидетельствует о патологической роли митохондриальных АФК в процессе повреждения головного мозга новорожденных после ишемического воздействия. В аналитической части проекта, посвященной анализу эффекта возрастных изменений в организме на прохождение сигналов в защитной клеточной сигнализации, были даны предложения по выходу из тупиковой ситуации, при которой исследования проводятся на молодых организмах, в то время как в клинике преобладают пожилые индивидуумы, к которым слишком часто не применимы рекомендации, сделанные в результате работы на молодых организмах. Мы предложили использовать комбинированный подход с акцентом на использование фармакологических препаратов, имеющих направленное митохондриальное воздействие (либо за счет осуществления антиоксидативной функции, либо за счет мягкого разобщения, когда немного снижается значение митохондриального мембранного потенциала, в то же время оставаясь на уровне, необходимых для осуществления синтеза АТР) и некоторые другие подходы, которые находятся в разработке. Одновременно мы даем рекомендации по увеличению внимания к исследованиям, где в качестве испытуемых находятся старые индивидуумы или работы на моделях преждевременного старения (например крыс линии OXYS).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".