Сахарный диабет 2 типа и метаболический синдром: выяснение молекулярных механизмов, ключевых сигнальных путей и транскрипционных факторов с целью определения биомишеней для новых лекарственных средствНИР

Type 2 diabetes and metabolic syndrome: identification of the molecular mechanisms, key signaling pathways and transcription factors aimed to reveal new therapeutical targets

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 5 мая 2017 г.-31 декабря 2017 г. Сахарный диабет 2 типа и метаболический синдром: выяснение молекулярных механизмов, ключевых сигнальных путей и транскрипционных факторов с целью определения биомишеней для новых лекарственных средств
Результаты этапа: 1). Шестакова М.В. С целью проверки гипотезы о роли гормонов инкретинового ряда в развитии ремиссии сахарного диабета в ходе МБО в исследование были включены 14 пациентов с сахарным диабетом и длительным анамнезом ожирения (более 10-15 лет), планирующих проведение билиопанкреатического шунтирования в модификации SADI. К моменту предоставления отчета все пациенты прооперированы. В ходе дооперационного обследования пациентам выполнен тест со смешанной пищей со взятием образцов крови в исходной точке, а также через 30 и 120 минут для будущей оценки профиля секреции гормонов поджелудочной железы, инкретинового ряда и адипокинов (на момент предоставления отчета материала недостаточно для проведения анализа). Для определения выраженности ИР всем пациентам перед проведением оперативного вмешательства выполнен гиперинсулинемический эугликемический клэмп-тест. Выявлено, что все пациенты исходно имели выраженную ИР (средние М-индекс 1,62 мг/кг/мин, индекс HOMA-IR 12,65), что характеризует тяжелую степень ИР. На момент отчета тесты проведены повторно у трети пациентов, что пока не позволяет анализировать динамику ИР. Группу сравнения составили 25 пациентов с длительным анамнезом ожирения и сахарным диабетом 2 типа, получающих терапию агонистом рецепторов ГПП-1 лираглутидом в дозе 3.0 мг с целью имитации максимального инкретинового эффекта. У пациентов оценена динамика веса, гликемии и ИР исходно и через 3-4 месяца после получения препарата: в среднем снижение веса в течение данного промежутка времени составило 6,2 кг, уровень гликированного гемоглобина крови снизился в среднем на 1,1%. Кроме того, на фоне имитации максимального инкретинового эффекта получено повышение значения М-индекса с 1,74 мг/кг/мин до 2,52 мг/кг/мин, что говорит о снижении выраженности ИР. Отобраны образцы плазмы для оценки динамики секреции гормонов инкретинового ряда. Для более детального анализа вклада инсулинорезистентности и дефектов секреции инкретинов в развитие сахарного диабета была также набрана группа пациентов с гиперкортицизмом и гиперсекрецией соматотропного гормона (акромегалией) как модели других эндокринных причин развития нарушений углеводного обмена. В исследование включены 20 пациентов с подтвержденным диагнозом БИК, 21 пациент с акромегалией и контрольная группа из 21 пациента, сопоставимого по возрасту и ИМТ без клиники гиперкортицизма и избыточной секреции соматотропного гормона. Все пациенты не получали до включения в исследование сахароснижающей терапии и терапии основного заболевания. Проводилось исследование степени ИР по индексу HOMA, а также секреции гормонов поджелудочной железы (инсулин, глюкагон) и инкретиновых гормонов (ГПП-1, ГИП). По результатам исследования было получено, что частота нарушений углеводного обмена (предиабета и манифестного сахарного диабета) составляла 55% у пациентов с БИК и 38% у пациентов с акромегалией. БИК и акромегалия характеризуются высокой степенью инсулинорезистентности, в 8 раз превышающие значения для общей популяции: значения HOMA-IR контрольной группы 2,0 [1,7;2,3], пациентов с БИК 17,8 [15,2;22,3], пациентов с акромегалией 16,3 [12,2;17,8]. Состояние гиперкортицизма сопровождалось выраженной гиперглюкагонемией как натощак, так и в ходе углеводной нагрузки. Секреция инкретиновых гормонов (ГИП, ГПП-1) у пациентов с БИК и акромегалией не зависела от степени нарушения углеводного обмена, что говорит об отсутствии влияния классических инкретиновых гормонов на развитие гипергликемии при БИК и акромегалии. Отсутствие значимого вклада инкретиновых гормонов в развитие гипергликемии отличает пациентов с вторичным эндокринным генезом сахарного диабета от пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Таким образом, наиболее существенными факторами риска развития нарушений углеводного обмена у пациентов с сахарным диабетом вторичного генеза являются ИР и гиперглюкагонемия. У пациентов с классическим сахарным диабетом 2 типа нарушение секреции инкретиновых гормонов и сниженный инкретиновый эффект являются причинами прогрессирования гипергликемии. Стимуляция выработки гормонов инкретинового ряда, в частности глюкагоноподобного пептида 1 типа (ГПП-1), приводит к компенсации углеводного обмена, воздействие на этот механизм реализуется при назначении инкретин-направленной терапии. Остаются непонятными механизмы ранней, происходящей в течение 10-15 минут после приема пищи, секреции ГПП-1, местом синтеза которого являются L-клетки дистальной части тонкой кишки. Для оценки центральной регуляции как потенциального механизма стимуляции синтеза ГПП-1 и коррекции нарушений углеводного обмена было проведено исследование по изучению влияния визуальных и обонятельных стимулов на секрецию ГПП-1. Здоровым добровольцам (5 мужчин и 8 женщин) 21-22 лет со средним ИМТ 21,7 кг/м2 были взяты образцы крови натощак для оценки базальной секреции инкретиновых гормонов. Затем им представлялся калорийный завтрак, в течение 20 минут добровольцы смотрели на еду и ощущали ее запах, однако не могли есть (1й этап). В этой фазе эксперимента образцы крови брались дважды. По прошествии 20 минут добровольцы принимали пищу, после этого образцы крови брались на 30 и 120 минутах (2й этап). По результатам исследования прироста инсулина в ходе 1 этапа не наблюдалось, закономерное увеличение секреции инсулина происходило после начала приема пищи. Предполагаемого увеличения выработки ГПП-1 в ходе 1 этапа также не наблюдалось: у половины пациентов, преимущественно с более высоким ИМТ, отмечался прирост ГПП-1, у половины пациентов прироста ГПП-1 не было или наблюдалось снижение его выработки. Гетерогенность полученных результатов требует дальнейшего изучения. 2).Ткачук В.А. В ходе выполнения проекта в 2017 году был проанализирован биопсийный материал 30 пациентов. Методом аллель-специфичной ПЦР был проведен скрининг полученных образцов жировой ткани. На основании данных исследований была отобрана группа пациентов, являющихся гомозиготами по полиморфизму PRKAA1 rs249429, описанному полиморфизму каталитической субъединицы АМФ-зависимой протеинкиназы (AMPK) а также контрольная группа пациентов. На первичной культуре МСК полученных от данных пациентов, имеющих различные генотипы, были отработаны протоколы дифференцировки МСК в адипогенном направлении, в том числе в присутствии метформина с последующей оценкой накопления липидных капель, а также экспрессии основных белков-маркеров адипогенной дифференцировки (PPARγ, C/EBPb, Адипонектин, GLUT4). Нами была создана система для эффективной генетической модификации МСК с использованием системы Cas9/CRISPR. Экспрессионные кассеты, кодирующие Cas9-HF, GFP и gRNA, были встроены в вектор pLKO.1, предназначенный для сборки лентивирусных частиц. Был проведен поиск и дизайн специфических gRNAs, способных направить программируемую эндонуклеазу Cas9 на экзоны генов интереса (PPARG, PRKAA1, PRKAG2) в МСК человека. Были отработаны методики модификации линии МСК. Используя лентивирусные векторы были получены линии иммортализованных МСК ASC52telo с измененной экспрессией PPARG, PRKAA1 и PRKAG2. Были отработаны протоколы дифференцировки линейных МСК в адипогенном направлении, в том числе в присутствии метформина или розиглитазона с последующей оценкой накопления липидных капель, а также экспрессии основных белков-маркеров адипогенной дифференцировки (PPARγ, C/EBPb, Адипонектин, GLUT4). Кроме этого в ходе выполнения проекта продолжается набор образцов крови здоровых доноров, больных СД2Т и пациентов с предиабетом. Полный анализ предполагаемых маркеров ИР в лейкоцитах перенесен на следующий этап проекта. Для первичных культур МСК жировой ткани был оптимизирован протокол ферментативного выделения с использованием коллагеназы I типа и диспазы, культивирования в течение 2-3 пассажей и последующей заморозки и разморозки. Клетки сохраняли жизнеспособность и дифференцировались с образованием зрелых адипоцитов (рис. 1А). Пилотные измерения инсулинового каскада в зрелых адипоцитах показали, что инсулин гораздо слабее или совсем не стимулирует фосфорилирования Akt в клетках больных СД2Т. На рис. 1Б приведена часть результатов для адипоцитов, дифференцированных из МСК подкожного жира метаболически здорового донора (Ж2904ХХ) и двух пациентов с СД2Т (Ж601949 и Ж5206ХХ). Все химические индукторы ИР (конъюгат БСА с пальмитатом, ЛПС, брефелдин А и Co2+) вызывали сходные нарушения инсулиновой сигнализации на уровне субстрата инсулинового рецептора (IRS-1, рис. 2) и регулятора инсулин-зависимого транспортера глюкозы Glut4 (белок AS160, рис. 3). При этом фосфорилирование Akt по инсулин-зависимым остаткам изменялось несколько различным образом, но было всегда снижено в условиях ИР (рис. 4 и рис. 5). Полученные результаты указывают на то, что уровень тирозинового фосфорилирования IRS-1 по остатку 612 и фосфорилирования AS-160 по серину-318 могут служить маркерами ИР различного генеза, тогда как использование фосфорилирования Akt в качестве маркера может быть менее оправданным, поскольку зависит от условий, ведущих к развитию ИР. Эти результаты подготовлены к публикации, но ожидают дополнения результатами. Кинетика накопления и деградации ингибиторной субъединицы IkB воспалительного транскрипционного фактора NF-kB показала крайнюю гетерогенность в зависимости от используемой модели индукции ИР (рис. 6). Достоверных результатов по накоплению фосфорилированной формы воспалительной протеинкиназы IKK получить не удалось, по видимому, из-за неадекватности фосфоспецифических антител (Phospho-IKKα/β, Cell Signaling #2697). В качестве альтернативного варианта была определена кинетика фосфорилирования JNK1 – основной киназы AP-1-зависимой ветви воспалительного каскада. Стабильно высокий уровень фосфорилирования JNK сохранялся во всех моделях химической индукции инсулиновой резистентности (рис. 6). Эти данные означают, что вклад IKK-зависимого воспаления в индукцию нарушения инсулиновой сигнализации в данных моделях химической индукции ИР неочевиден, тогда как JNK-зависимое воспаление активируется во всех случаях. Таким образом, активация воспалительного каскада маркирует состояние ИР различного генеза; в совокупности с фосфорилированием IPS-1 и AS-160, фосфорилирование JNK1 может служить показателем (маркером) ИР в жировых клетках. В резистентных адипоцитах (модель жировой диеты с пальмитиновой кислотой) была исследована способность ингибиторов воспалительных киназ восстанавливать активность инсулиновой сигнализации. В концентрации 1 мкМ ингибитор IKK-киназы IKK-16 не давал значимого эффекта на восстановление инсулин-зависимого фосфорилирования IRS-1 и Akt (рис. 7), а также на накопление/деградацию IkB (рис. 8). В более высоких концентрациях (3 и 7 мкМ) IKK-16 оказывал цитотоксический эффект, что видно по снижению уровня белков-контролей нагрузки GAPDH и IRS-1 (рис. 7). IKK-16 вызывал также деградацию IkB в концентрации 3 мкМ, что может указывать на индукцию стрессового состояния клетки. В связи с неэффективностью IKK-16, был применен альтернативный подход и использованы другие ингибиторы воспалительного каскада. Наилучшие результаты расширенного ингибиторного анализа дали ингибиторы JNK1 и p38 стресс-активируемых МАР-киназ (рис. 9). Мы не обнаружили существенных изменений уровня фосфорилирования компонентов инсулинового каскада (IRS, Akt и eNOS) ни в условиях дислипидемии, ни в условиях карбонильного стресса, связанного с гипергликемией (данные не представлены). Поэтому были расширены и доведены до публикации результаты, описанные в отчете за прошлый год. Они свидетельствуют о том, что прямое действие МДА и подобных аддуктов карбонильного стресса на цитоскелет и барьерную функцию может быть главным повреждающим фактором в эндотелии в условиях дислипидемии. На рис. 10 показаны результаты, иллюстрирующие повреждающее действие МДА на эндотелиальный цитоскелет, в то время как структура цитоскелета остается относительно интактной при воздействии глиоксаля и метилглиоксаля. Мы установили, что только при гиперлипидемии (дислипидемии), но не при гиперинсулинемии и гипергликемии, нарушается высокомолекулярная проницаемость эндотелия EA.hy926 (см. рис. 11). Пр этом нарушение не было сильным, но проявлялось не только при воздействии тромбина (классического стимулятора проницаемости), но и в стационарных условиях. Эти результаты согласуются с вышеописанными экспериментаим по инсулиновой сигнализации и карбонильному стрессу в эндотелии: в условиях кратковременного моделирования дислипидемии (~ 1 сутки) не происходит серьезных нарушений инсулинового каскада и значительного накопления МДА, который оказывает основное повреждающее воздействие. Были проведены пилотные эксперименты и получены первые данные по синтезу NO клетками EA.hy926. Для этого использовали реактивы Грисса (N-нафтил-этилендиамин, фосфорная кислота и сульфаниламид) и 100 нМ тромбина и инсулина для стимуляции в течение 24 часов. Мы выяснили, что инсулин стимулирует продукцию NO этими клетками приблизительно в 2 раза, тогда как классический стимулятор тромбин обладает более выраженным действием, стимулируя синтез NO примерно в 7 раз (рис. 12). Мы обнаружили, что ФИТЦ-инсулин транспортируется сквозь эндотелиальные клетки в везикулах, и обработка клеток динго 4а вдвое сокращает его транспорт через монослой (рис. 13). При этом динго 4а не влияет на межклеточный перенос 70 кДа ФИТЦ-декстрана (рис. 14) и, следовательно, ФИТЦ-инсулина, как более мелкой молекулы. В этих экспериментах мы установили оптимальную концентрацию динго 4а. Она составила 30-50 микроМ. Дальнейшее увеличение концентрации ингибитора динамина не приводило к усилению эффекта. Ингибирование каталитической активности L-КЛЦМ в клетках EA.hy926 с помощью ПИК2 в 5 раз подавляет транспорт ФИТЦ-инсулина. Аналогично, транспорт ФИТЦ-инсулина оказался чувствительным к блеббистатину, указывая на участие немышечного миозина II в этом процессе (рис. 13). Следует отметить, что эффект блеббистатина был слабее, чем эффект ПИК2, что не совсем логично и, возможно, объясняется низким качеством препарата блеббистатина. Был заказан другой препарат блеббистатина, однако этот реактив не был получен до составления отчета. Он будет проверен на клетках EA.hy926 на следующем этапе. Полученные результаты означают, что наша модельная система адекватно воспроизводит трансцеллюлярный перенос инсулина через эндотелий и может быть использована в запланированных исследованиях. Мы впервые показали, что инсулин переносится через монослой клеток эндотелия EA.hy926 активным динамин-зависимым образом, а L-КЛЦМ играет важную роль в регуляции транспорта инсулина. Подавление активности L-КЛЦМ с помощью нового ингибитора ПИК2 снижает транспорт инсулина на 80%. По-видимому, КЛЦМ действует через миозин II и высвобождение содержимого везикул на вентральной стороне эндотелиальных клеток (Khapchaev and Shirinsky, 2016). По-видимому, ПИК2 не влияет на парацеллюлярную диффузию ФИТЦ-декстрана в нестимулированных клетках EA.hy926 (Khapchaev et al., 2016), и не снижает межклеточную диффузию более низкомолекулярного ФИТЦ-инсулина. Исходя из этого, можно оценить межклеточную диффузию инсулина в 20% в модельных клетках EA.hy926. 3). Гусев Н.Б. Установлено, что при инкубации с метилглиоксалем происходит модификация нескольких остатков аргинина в структуре малого белка теплового шока человека HspB1. Эти остатки преимущественно расположены в подвижном и мало упорядоченном N-концевом домене белка. Модификация метилглиоксалем не сопровождается значительными изменениями четвертичной структуры и шапероноподобной активности HspB1. Проведены эксперименты с клетками HeLa и HEK293F, которые выращивались в присутствии повышенной концентрации глюкозы и/или метилглиоксаля. Экстракт, полученный при разрушении клеток, наносили на колонку с иммобилизованными моноклональными антителами на HspB1 и анализировали белковый состав фракций, сорбировавшихся на аффинном носителе, методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии мочевины. Используемый метод позволяет выявит такие посттрансляционные модификации HspB1, как фосфорилирование и/или любые иные посттрансляционные модификации, сопровождающиеся изменением суммарного заряда белка. К сожалению, оказалось, что ни при инкубации в высокой концентрации глюкозы, ни при инкубации в присутствии метилглиоксаля не удается выявить существенной модификации HspB1 метилглиоксалем. Проведен анализ литературы, касающейся модификации малых белков теплового шока метилглиоксалем. Оказалось, что указанная модификация в наибольшей степени характерна для белков с низкой скоростью обмена, таких как различные формы кристаллина. Вероятность модификации возрастает в тканях, энергетическое обеспечение которых преимущественно зависит от гликолиза (различные виды опухолей). Модификация in vitro высокими концентрациями метилглиоксаля сопровождается существенными изменениями четвертичной структуры и образованием «сшитых» белковых комплексов. В зависимости от природы используемого субстрата модификация метилглиоксалем может сопровождаться как увеличением, так и уменьшением шапероноподобный активности малых белков теплового шока. Сделан вывод, что наиболее перспективным объектом исследования модификации метилглиоксалем представляются различные формы кристаллина. Проведен анализ влияния различных малых белков теплового шока на сборку филаментов, образуемых легкой цепью нейрофиламентов. Установлено, что HspB1 и HspB5 эффективно связываются с белком легкой цепи нейрофиламентов и ингибируют процесс сборки нейрофиламентов. Точечные аминокислотные замены в структуре HspB1, коррелирующие с развитием нейродегенеративных заболеваний, не оказывают существенного влияния на взаимодействие этого белка с нейрофиламентами. Два других малых белка теплового шока, HspB6 и HspB8, менее эффективно взаимодействуют с белком легкой цепи нейрофиламентов и не оказывают существенного влияния на его полимеризацию. Осуществлена кристаллизация комплекса фосфорилированного малого белка теплового шока HspB6 и универсального адаптерного белка 14-3-3. Впервые установлена структура полноразмерного малого белка теплового шока человека. Показано, что образующийся комплекс асимметричен и HspB6 оказывается связанным с 14-3-3 как за счет своего фосфопептида, так и за счет кристаллинового домена. Установлено, что при высокой концентрации HspB6 может влиять на свойства растворителя и это может играть важную роль в его взаимодействии с белками-мишенями. Исследована структура и физико-химические свойства трех точечных мутантных форм альфаВ-кристаллина (HspB5) с заменами G154S, R157H и A171T, экспрессия которых коррелирует с некоторыми формами кардиомиопатии и/или катарактой. Установлено, что точечные замены сопровождаются минимальными изменениями четвертичной структуры, однакоприводят к уменьшению термической стабильности исследуемых белков. Исследуемые белки с одинаковой эффективностью взаимодействуют с малым белком теплового шока HspB1, однако мутантная форма R157H отличается от белка дикого типа и двух других мутантных форм по своей способности взаимодействовать с другим малым белком теплового шока, HspB6. Установлено, что в отличие от двух других мутантных форм и белка дикого типа, белок с точечной заменой R157H отличается по прочности своего взаимодействия с малым белком теплового шока HspB4. Обнаружено, что, как правило, все исследуемые белки обладают пониженной шапероноподобной активностью по сравнению с белком дикого типа. Высказано предположение, что выявленные различия обусловлены изменением ориентации или подвижности консервативного участка, содержащего последовательность IPI и обеспечивающего межсубъединичные взаимодействия в составе крупных гомоолигомерных комплексов HspB5.
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Сахарный диабет 2 типа и метаболический синдром: выяснение молекулярных механизмов, ключевых сигнальных путей и транскрипционных факторов с целью определения биомишеней для новых лекарственных средств
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".