ИСТИНА

Выяснение принципов функционирования живых систем требует тесной интеграции молекулярных подходов, в том числе методов геномики и протеомики, с детальным количественным анализом структурной организации клеток и субклеточных компартментов с целью максимально точного картирования биомолекул различной природы и определения механизмов биогенеза клеточных структур. Практические аспекты данного рода исследований определяются тем, что понимание структурной организации и динамики клеточных структур имеет огромное значение в биомедицинских исследованиях, способствуя развитию новых технологий диагностики и лечения заболеваний различной природы. Целью настоящего исследования, таким образом, является комплексное исследование субклеточной организации клеток эукариот в норме и при патологии и разработка новых методических подходов для мультимодального микроскопического анализа клеточных структур. Работа направлена на выяснение принципов молекулярной и надмолекулярной организации клеток высших эукариот, что остается одной из наиболее актуальных проблем современной биологии. Исследования в этой области чрезвычайно активизировались в последние годы, что объясняется несколькими причинами. С одной стороны, успехи протеомики и геномики, разработка новых методов молекулярно-биологического и микроскопического анализа позволяют более глубоко изучать клетку , ее органеллы. С другой стороны, медицина, биотехнология и нанотехнологии требуют все более точного описания клеточной организации, что необходимо для разработки новых лекарств, материалов, технологий. Таким образом, на данном этапе развития науки появилась возможность и осознана необходимость широкого изучения самых общих принципов организации клетки эукариот.Выяснение таких принципов является темой настоящей работы.

The work is aimed at clarifying the principles of molecular and supramolecular organization of cells of higher eukaryotes, which remains one of the most urgent problems of modern biology. Research in this area is extremely active in recent years, due to several reasons. On the one hand, advances in proteomics and genomics, development of new methods of molecular-biological and microscopic analysis allows to study more deeply the cell and its organelles. On the other hand, medicine, biotechnology and nanotechnology require a more accurate description of the organization of the cell, it is necessary to develop new drugs, materials, technologies. Thus, at this stage of development of science has emerged an opportunityand matured the demand for a broad study of the most common principles of eukaryotic cell organization.Elucidation of such principles is the subject of this study.

1) Будет проведен систематический поиск веществ, обладающих анти-тропомиозиновым и анти-микротрубочковым эффектом. Будут созданы экспериментальные модели in vitro, в которых вещества, обладающие анти-тропомиозиновым и анти-микротрубочковым эффектом будут действовать синергично и будут исседованы механизмы синергетического эффекта. 2) Будет проведен анализ взаимодействия микротрубочек с фокальными контактами и исследована динамика образования и разборки фокальных контактов на примере клеток, трансфецированных «ранними» и «поздними» (винкулин) белками фокальных контактов. 3) Будут исследованы особенности белкового состава и кинетики сборки порового комплекса в клетках, экспрессирующих прогерин в процессе нормального старения. Будут использованы иммунофлуоресцентный анализ для исследования локализации белков-нуклеопоринов и будут сконструированы конструкции, кодирующие белки, связанные с GFP. 4) Будет изучен процесс сегрегации компонентов проядрышек с использованием метода анализа молекулярных взаимодействия FRET, а так же изучение роли GAR-домена фибрилларина в специфическом накоплении белка в сегрегировавших компонентах интерфазных проядрышек.

Данное направление исследований развивалось в НИИ ФХБ с момента его основания в 1965 году. Основные интерезы научных групп, участвующих в разработке тематики, сосредоточено на морфофункциональных исследованиях клеточного ядра, систем цитоскелета и структуры и функуии митохондрий в норме и патологии. Были разработаны оригинальные методики исследований, включавшие в первую очередь методы мультимодальной мультимасштабной микроскопии, в том числе корреляционные подходы. Были получены важные данные в пользу модели иерархической укладки ДНК в составе интерфазных и митотических хромосом и исследована роль архитектурных белков хроматина в реконструкции высших уровней компактизации ДНК после репликации. Были исследованы динамические свойства микротрубочек как важного фактора регуляции барьерной функции эндотелия и дифференциальная роль подсистем актинового цитоскелета, сформированного бета- и гамма-изоформати актина, в цитоплазматических и дерных процессах. Была исследована роль ядерной ламины в регуляции механических свойств ядра и влияние мутантных форм ламина А на пространственную организацию хроматина в ядре.

1) Анализ расположения слитого с GFP белка - нуклеопорина POM-121 в составе ядерной оболочки при транзитной трансфекции клеток с использованием иммунофлуоресцентного анализа показал неравномерность встраивания этого белка в индивидуальные ядерные поры. При этом в состаренных in vitro фибробластах человека ядерные поры нормальной морфологии в составе ядерной оболочки расположены достаточно равномерно, в количестве 10-12 комплексов пор на мкм2. 2) Получены плазмиды для анализа межмолекулярных взаимодействий в составе интерфазных проядрышек (ECFP-NPM1 и FBL-EYFP). Проанализированы взаимодействия между NPM1 и FBL на ранних этапах формирования проядрышек, когда эти два белка колокализуются на уровне световой микроскопии. Показано, что GAR-домен фибрилларина накапливается в части проядрышка, содержащей NPM1, а не FBL. 3) Проведен систематический поиск веществ, обладающих анти-тропомиозиновым и анти-микротрубочковым эффектом. В ходе скрининга из возможных кандидатов выбраны два вещества - TR100 и ATM-3507. Созданы экспериментальные модели восьми культивируемых in vitro опухолевых клеток человека (нейробластом линий CHLA-20, CHLA-90, SK-N-BE(2), SK-N-SH, SH-SY5Y, CHP-134, SKMEL-28 и PC3). Анализ взаимодействия клеток перечисленных линий с веществами, обладающиим анти-тропомиозиновым (ATM-3507 и TR100) и анти-микротрубочковым (винкристин и винбластин) эффектом, позволил выбрать для дальнейших исследований модели, в которых эти вещества действуют синергично. На модели клеток CHLA-20 показано, что оба антитропомиозиновых вещества в сочетании с винкристином блокируют митотическое деление клеток в фазе G2 – M, что происходит из-за нарушений формирования нормального митотического веретена и приводит апоптозу.