ИСТИНА

В проекте будут исследованы структурные и молекулярные особенности белок-белковых и липид-белковых взаимодействий ключевых актинсвязывающих белков. Эта фундаментальная проблема является весьма актуальной, так как многие актинсвязывающие белки до сих пор не закристаллизованы и их атомная структура не известна. Для изучения структуры и конформационных изменений будут использованы современные аналитические методики. На основании разработанного нами ранее комплексного подхода, включающего методики криогенной микроскопии и биоинформатики планируется осуществить трехмерную реконструкцию структуры актинсвязывающих молекул и рассчитать их псевдо-атомную структуру. Научная новизна планируемых исследований состоит в том, что будут получены данные, раскрывающие на молекулярном уровне не изученные прежде специфические взаимодействия между актинсвязывающими белками, их лигандами, актином и липидами. После опубликования, эта информация может быть применена для планирования экспериментов по направленному мутагенезу с целью идентификации функционально значимых участков в молекулах актинсвязывающих белков-мишеней лекарственных средств.

The project will explore the structural and molecular features of protein-protein and lipid-protein interactions of key actin-binding proteins. This fundamental problem is highly relevant, since many actin-binding proteins have not yet been crystallized and their atomic structure is not known. To study the structure and conformational changes will be used modern analytical techniques. Based on the complex approach developed by us earlier, including cryogenic microscopy and bioinformatics techniques, it is planned to carry out a three-dimensional reconstruction of the structure of actin-binding molecules and calculate their pseudo-atomic structure. The scientific novelty of the planned studies is that data will be obtained that reveal, at the molecular level, the previously unknown specific interactions between actin-binding proteins, their ligands, actin and lipids. After publication, this information can be used to plan experiments on directed mutagenesis in order to identify functionally significant sites in the molecules of actin-binding target proteins of drugs.

В данной работе мы планируем получить впервые трехмерные (3D) структуры актинсвязывающего комплекса Arp2/3 с Gmf и другими инактиваторами (арпин, Crn). Для оценки свободной энергии связывания инактиваторов с Arp2/3 комплексом мы применим метод молекулярной динамики. Для построения профиля свободной энергии будет использован метод зонтичного сэмплирования (umbrella sampling). С его использованием свободная энергия может быть вычислена из потенциала средней силы, рассчитываемого для серии конформаций, получаемых в результате молекулярной динамики. Для определения структур высшего порядка, формируемых F-BAR белками на мембранах и определения трехмерной структуры полноразмерного Nwk, мы используем метод ПЭМ с негативным контрастированием. Введение точечных мутаций позволит определить аминокислотные остатки, участвующие в межбелковом взаимодействии и взаимодействии с активаторами (например с Dap160 (1)). Мы впервые получим 3D реконструкцию полноразмерного Srv2 комплекса, которая в сочетании с томографическими исследованиями и результатами молекулярного моделирования позволит построить молекулярную модель полноразмерного человеческого комплекса CAP. Для интерпретации полученных структурных данных мы планируем разработать методику интеграции данных ПЭМ с известными данными по атомной структуре АСБ. Для интеграции данных будут использованы методы молекулярной динамики с использованием параллельных суперкомпьютерных вычисления для релаксации предварительных структур комплексов (будет использован программный пакет GROMACS 4.6 (2) и суперкомпьютер МГУ «Ломоносов»), методы гибкого докинга (3), основанные на методе молекулярной динамики, позволяющие проводить деформацию молекулярных структур белков, вписывая их в экспериментальную электронную плотность. Возможность взаимной интеграции классического метода электронной микроскопии с современными вычислительными техниками для расчета трехмерной структуры комплекса, а так же для молекулярного моделирования структуры, позволяет существенно ускорять и удешевлять определенные этапы исследования объектов.

Группа структурной биотехнологии под руководством д.б.н. О.С. Соколовой успешно реализовывала несколько проектов по структурной биологии в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 годы», в создании опережающего научного задела и совершенствовании элементов научной инфраструктуры в области исследования структуры и функций белковых молекул.

Про поддержке РНФ исследовались структуры и функции белков, регулирующих динамику актинового цитоскелета: Arp2/3, CAP/Srv2 и Nwk. Эти белки были выбраны для исследования в связи с тем, что 1) они являются ключевыми для функционирования цитоскелета, а значит и поддержания формы и обеспечения движений клетки; 2) они имеют отношение к различным процессам сборки и разборки актиновых филамент в клетке. Это особенно важно в связи с тем, что взаимодействие цитоскелета и мембраны определяет характер движений и изменения формы эукариотической клетки в процессе ее морфогенеза. Нарушения в подвижности клеток приводят к драматическим последствиям для всего организма. Все запланированные исследования по проекту были выполнены полностью и в срок. За прошедшие 4 года получены новые данные, раскрывающие на молекулярном уровне специфические взаимодействия между актинсвязывающими белками, их лигандами и липидами. Исследования проводили с использованием разработанного нами комплексного подхода, включающего в качестве основного, но не единственного метода просвечивающую электронную микроскопию, а также электронную томографию, молекулярное моделирование, флуоресцентную микроскопию, TIRF, молекулярно-биологические и биохимические методы. По результатам работ опубликованы статьи в журналах с высоким импакт-фактором, защищены: диссертация на соискание степени к.б.н. по специальности «биофизика» и диплом специалиста на биофаке МГУ имени М.В,Ломоносова. Результаты докладывались на международных конференциях.