ИСТИНА

CBS-пирофосфатазы относятся к так называемому семейству II пирофосфатаз, которые гидролизуют пирофосфат в присутствии ионов Mg2+ и имеют в своем составе прочно связанный ион Co2+ или Mn2+. Каждая субъединица CBS-пирофосфатазы состоит из двух каталитических доменов и регуляторной части, образованной парой нуклеотид-связывающих CBS-доменов и одним DRTGG-доменом. Активный центр расположен между каталитическим доменами. Связывание AMP и ADP в CBS-доменах ингибирует фермент, тогда как связывание ATP и диаденозинполифосфатов активирует его. Известна пространственная структура отдельной регуляторной части в виде гомодимера и гомологичных каталитических доменов «канонической» пирофосфатазы семейства II, которая не имеет регуляторной части. Ранее мы показали, что связывание мононуклеотидов и субстрата характеризуется положительной кооперативностью, что указывает на взаимовлияние субъединиц (статья 1 в списке публикаций). Целью проекта является проверка гипотезы о том, что регуляторный сигнал передается из центра связывания нуклеотида в CBS-доменах в активный центр каталитического домена через зону контакта каталитических субъединиц. Иными словами, предполагается, что связывание нуклеотида изменяет структуру зоны контакта пар CBS-доменов двух субъединиц, это изменение передается в зону контакта каталитических доменов разных субъединиц, а оттуда в активные центры. В рамки этого гипотетического механизма (механизма «ножниц») хорошо укладывается ряд уже известных фактов: кооперативность связывания, зависимость направления эффекта (ингибирование или активация) от размера нуклеотида и высокая прочность комплексов с нуклеотидами (Kd = 0,01–1 мкМ). Объектами исследования будут CBS-пирофосфатазы бактерий Desulfitobacterium hafniense, Ethanoligenens harbinense и Eggerthella lenta, канонические пирофосфатазы семейства II из бактерий Streptococcus gordonii и Bacillus subtilis, а также каталитический и регуляторный фрагменты пирофосфатазы из D. hafniense. В нашем распоряжении есть соответствующие генетические конструкции (кроме гена регуляторного фрагмента пирофосфатазы из D. hafniense) и клетки Escherichia coli, продуцирующие белки дикого штамма. Планируемые исследования будут состоять из трех частей. В первой части мы определим олигомерную структуру CBS-пирофосфатазы, чтобы ответить на вопрос, образует ли она димеры, как каноническая пирофосфатаза, или дает более сложные структуры. Мы также оценим влияние нуклеотидов на прочность олигомерной структуры и определим активность мономерной формы фермента, для чего подберем условия для его диссоциации (рН, температура) или, если это не удастся, произведем замены аминокислотных остатков в зоне контакта субъединиц. Во второй части работы мы определим вклад CBS- и DRTGG-доменов в прочность межсубъединичного контакта. Для этого мы привлечем CBS-пирофосфатазы из E. harbinense и E. lenta, которые не имеют в своем составе DRTGG-домен, который, по имеющимся кристаллографическим данным, также вовлечен в межсубъединичный контакт. Кроме того, мы определим прочность олигомерных структур, образуемых отдельными каталитической и регуляторной частями CBS-пирофосфатазы и влияние нуклеотидов. В третьей части работы мы оценим роль регуляторной части CBS-пирофосфатаз в проявлении каталитической кооперативности. С этой целью мы планируем исследовать кинетику реакции, катализируемой пирофосфатазами из S. gordonii и B. subtilis, а в случае обнаружения кинетической кооперативности, провести в них сайт-направленный мутагенез остатков, отвечающих за проявление кинетической кооперативности для обнаружения корреляции между взаимовлиянием активных центров и прочностью олигомерной структуры. В работе будет использован комплекс современных биоинформатических, биохимических, физико-химических и молекулярно-генетических методов. Все планируемые результаты будут новыми, не описанными в литературе.

CBS-pyrophosphatases belong to the so-called Family II pyrophosphatases, which hydrolyze pyrophosphate in the presence of Mg2+ ions and contain a tightly-bound Co2+ or Mn2+ ion. Each subunit of CBS-pyrophosphatase is composed of two catalytic domains and a regulatory part formed by a pair of CBS and one DRTGG domains. The active site locates between the catalytic domains. AMP or ADP bound to the CBS domains inhibit whereas ATP or diadenosine polyphosphates activate CBS-pyrophosphatase. Tertiary structures of a separate regulatory part and homologous catalytic domains of “canonical” Family II pyrophosphatase (lacking the regulatory part) have been reported. We have earlier demonstrated that adenine mononucleotide and substrate binding to CBS-pyrophosphatase is positively cooperative, indicating subunit interdependence. The project aims at testing the hypothesis that the regulatory signal is transmitted from the nucleotide-binding site in the CBS domains to the active site of the catalytic domains via the subunit interface. In other words, it is assumed that nucleotide binding changes the contact zone between the CBS domain pairs belonging to different subunits, the change is transmitted to the contact zone between the catalytic domains and further to the active sites. This hypothetical “swinging” mechanism is fully consistent with known properties of the regulation, such as binding cooperativity, dependence of the sign of the effect (inhibition or activation) of nucleotide size, and high stability of the nucleotide complexes (Kd of 0.01-1 microM). The proteins to be studied will include the CBS-pyrophosphatases of the bacteria Desulfitobacterium hafniense, Ethanoligenens harbinense and Eggerthella lenta, the canonical Family II pyrophosphatases of the bacteria Streptococcus gordonii and Bacillus subtilis, as well as the catalytic and regulatory fragments of the D. hafniense CBS-pyrophosphatase. All genetic constructs, except for D. hafniense CBS-pyrophosphatase regulatory fragment gene, and the Escherichia coli cells producing the wild type proteins are available to us. The planned studies will consist of three parts. First, we will determine the oligomeric structure of CBS-pyrophosphatase to find out whether it forms dimers, like the canonical pyrophosphatase, or forms higher-order structures. We will also estimate the effects of the nucleotides on oligomer stability and the activity of the monomeric form by finding conditions that would favor oligomer dissociation (pH, temperature). Alternatively, we will make amino acid substitutions in the subunit contact region. Second, we will estimate the contribution of the CBS and DRTGG domains into oligomer stability. To this end, we will explore E. harbinense and E. lenta CBS-pyrophosphatases, which lack a DRTGG domain involved in subunit contact, based on X-ray crystallographic evidence. Furthermore, the stability of the oligomeric structures formed by separate catalytic and regulatory parts of CBS-pyrophosphatase will be determined. Third, we will estimate the role of the regulatory part in CBS-pyrophosphatase kinetic cooperativity. This will be accomplished by a kinetic analysis of the reaction catalyzed by S. gordonii and B. subtilis canonical pyrophosphatases. If cooperativity is detected, we will perform site-directed mutagenesis of the residues responsible for it to find our whether a correlation exists between active site interdependence and oligomeric structure stability. This study will employ a set of contemporary bioinformatic, biochemical, physico-chemical and molecular genetics methods. All the planned results will be novel, not reported previously.