![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Одной из основных проблем в борьбе с ВИЧ-инфекцией является быстрое возникновение устойчивости к лекарственным средствам на основе ингибиторов вирусных ферментов. В связи с этим, представляется весьма перспективным новый подход к ингибированию ВИЧ-1, основанный на подавлении тех стадий репликации вируса, в которых, наряду с вирусными, участвуют клеточные белки. Так показано, что ингибирование связывания вирусной интегразы с транскрипционным ко-активатором LEDGF/p75, который определяет направление интеграции вирусной ДНК в геном клетки, подавляет репликацию ВИЧ-1. Важным участником жизненного цикла ВИЧ-1 является также клеточный белок Ku. В клетках, дефектных по Ku, уровень репликации ВИЧ-1 понижен. Основной функцией этого белка в клетке является узнавание и связывание концов двухцепочечных ДНК, например, в процессе репарации путем негомологичного объединения концов (NHEJ). Белок Ku является гетеродимером, состоящий из двух субъединиц Ku70 и Ku80. Предполагается, что Ku вовлечен в несколько стадий жизненного цикла ВИЧ-1. Показано, что взаимодействие с субъединицей Ku70 предохраняет важнейший вирусный фермент интегразу от протеасомной деградации. Предполагается, что Ku70 взаимодействует с С-концевым доменом ИН, содержащим большое количество остатков лизина, по которым может происходить убиквитинилирование. Также, ряд данных свидетельствует о том, что белок Ku способен связываться с вирусным промотором в составе интегрированной ДНК ВИЧ-1 и активировать транскрипцию, однако конкретные детали этого процесса еще не известны. Настоящий проект направлен на исследование влияния клеточного белка Ku на несколько стадий в процессе репликации ВИЧ-1 с целью выявления новых мишеней для создания противовирусных препаратов. Во-первых, мы предполагаем исследовать роль ядерной протеолитической машины в деградации интегразы, а также влияние Ku на этот процесс. Важной частью этой работы является определение участков и аминокислотных остатков в структуре интегразы, непосредственно участвующих во взаимодействии с Ku70. Работа по изучению убиквитинилирования и протеасомной деградации интегразы ВИЧ-1 и ее защите белком Ku позволит оценить, может ли комплекс интегразы с Ku являться новой мишенью для разработки анти-ВИЧ препаратов. Вторым направлением работы станет исследование влияния белка Ku на транскрипцию провирусной ДНК и, в частности, определение участка промотора, с которым связывается Ku, и механизма этого связывания. Исследование связывания Ku с ДНК осложняется выбором адекватной модели, поскольку, исходя из механизма NHEJ, гетеродимер Ku70/Ku80 связывается с концом линейной ДНК (в том числе и закрытым петлей). Понятно, что в случае интегрированной ДНК такой механизм связывания Ku с ней невозможен. Соответственно, работа будет начата с создания соответствующей модели, одним из вариантов которой могут быть ДНК-дуплексы, концы которых закрыты объемными группировками. Далее предстоит выяснить, с какой именно последовательностью вирусного промотора связывается Ku и каким образом происходит это связывание. Мы планируем также исследовать, взаимодействует ли гетеродимер Ku70/Ku80 или одна из его субъединиц с конструкцией, представляющей модель провирусной ДНК с одноцепочечными разрывами, поскольку показано, что аппарат NHEJ может быть задействован в процессе репарации этих разрывов после интеграции в геном. Исследование механизмов взаимодействия белка Ku с указанными выше моделями ДНК позволит понять, может ли ингибирование этих Ku-ДНК взаимодействий стать новым подходом к подавлению репликации ВИЧ-1.
One of the main problems in the fight against HIV is the fast emergence of resistance to drugs which are based on the viral enzymes inhibitors. Considering this fact, a promising approach to HIV-1 inhibition should be based on suppressing those virus replication stages which involve cellular proteins besides the viral ones. Inhibiting the binding of the viral integrase to the transcription co-activator LEDGF/p75 which guides the direction of the viral DNA integration into the cellular genome has been shown to suppress the HIV-1 replication. An important participant of the HIV-1 life cycle is the cellular protein Ku. The cells depleted of Ku demonstrate a lower level of HIV-1 replication. The main function of this protein is recognition and binding to double-stranded DNA ends, mainly during DNA repair by non-homologous end joining (NHEJ). Ku is a heterodimer and consists of Ku70 and Ku80 subunits. Ku is expected to participate in several stages of HIV-1 life cycle. The interaction between Ku70 and integrase is shown to prevent integrase from proteasomal degradation. Supposedly, Ku70 interacts with the C-terminal domain of integrase that contains many lysine residues which can be ubiquitinated. Moreover, some data demonstrate that Ku is capable of binding to the viral promoter in the integrated HIV-1 proviral DNA that promotes transcription activation. However, specific details of this process are yet unknown. The present project aims at investigating the influence of Ku onto several stages of HIV-1 replication cycle in order to reveal new targets for antiviral drug development. At first, we propose to investigate the role of the nuclear proteolytic machinery in the integrase degradation, as well as the Ku influence onto this process. An important part of this project is defining the integrase regions and amino acid residues which directly participate in the interaction with Ku70. Studying the ubiquitination and the proteasomal degradation of the HIV-1 integrase and its protection by the Ku protein will allow assessing if the complex between Ku and integrase could be a new target for the development of antiviral drugs. An another direction of the present project is the investigation of the Ku influence on the transcription of the proviral DNA. In particular, a region of the promoter should be determined which is bound by Ku and the binding mechanism should be identified. Investigation of the Ku binding to DNA is complicated by the problem of choosing an appropriate model, as, given the NHEJ mechanism, the Ku70/Ku80 heterodimer binds to the linear DNA ends (also when they are covered by a loop). This mechanism cannot take place when the viral DNA is integrated. Thereafter, the project will start with constructing an appropriate model. One of the model variants can be based on DNA duplexes with the ends blocked by spacious groups. Further, we should find out exactly how Ku binds to the viral promoter and to which nucleotide sequence. We plan to investigate if the heterodimer Ku70/Ku80 or one of its subunits interacts with a model of proviral DNA with single strand breaks, because the NHEJ machinery has been shown to participate in the single strand breaks repair after the viral integration into the genome. Exploration of the mechanisms of the Ku interaction with the above mentioned DNA models will allow understanding if inhibiting of these interactions between Ku and DNA could be a new approach to the repression of the HIV-1 replication.
1. Выяснение механизма убиквитинилирования и протеасомной деградации интегразы ВИЧ-1. 2. Уточнение роли клеточного белка Ku в защите интегразы от протеасомной деградации и определение структуры комплекса Ku с интегразой. Если Ku действительно защищает интегразу и тем самым способствует повышению эффективности интеграции вирусной ДНК в геном человека, то комплекс интегразы с Ku может являться новой мишенью для разработки анти-ВИЧ препаратов. 3. Идентификация участка связывания клеточного белка Ku с промотором ВИЧ-1 и определение механизма этого связывания. Это позволит предложить новый механизм активации транскрипции с вирусного промотора и в дальнейшем разработать новые подходы к подавлению репликации ВИЧ-1. 4. Выяснение возможности участия компонентов системы репарации двуцепочечных разрывов, белка Ku и каталитической единицы ДНК-зависимой протеинкиназы DNA-PK, в репарации провирусной ДНК с одноцепочечными разрывами.
В коллективе накоплен большой опыт наработки в клетках E.coli, выделения, очистки и работы с рекомбинантными препаратами белков, содержащих His6-tag и GST-tag. Также группа имеет опыт работы с культурами эукариотических клеток. Получены многие плазмидные конструкции, необходимые для выполнения проекта: конструкции для прокариотической экспрессии His6-tag меченной интегразы и различных ее мутантов; конструкции для эукариотической экспрессии НА-меченных ИН и нескольких ее форм, содержащих мутации в С-концевом домене; конструкции для прокариотической экспрессии GST-Ku70 и для эукариотической экспрессии Ku70-3Flag. Ведется работа по получению конструкций для прокариотической и эукариотической экспрессии Ku80. Коллектив владеет методиками изучения взаимодействия белков методом pull-down и коиммунопреципитации из трансфецированных клеток, а также методами белкового кросс-линкинга. Коллектив обладает большим опытом в области синтеза олигодезокси- и олигорибонуклеотидов, а также их всевозможных модифицированных аналогов (аффиннные таги, флуорофоры, модификации для ДНК-белкового кросс-линкинга). Многие типы модификаций НК впервые предложены участниками данного проекта (Zatsepin et al, 2002; Dolinnaya et al, 2009; Agapkina et al, 2011). В группе накоплен большой опыт исследования НК-белковых взаимодействий с использованием различных физических и химических методов (Ryazanova et al, 2011; Anisenko et al, 2012). Многие реагенты для для ДНК-белкового кросс-линкинга разработаны участниками настоящего проекта (Metelev et al, 2006; Sud'ina et al, 2006).
Настоящий проект направлен на исследование влияния белка человека Ku, представляющего собой гетеродимер Ku70/Ku80, на процесс репликации ВИЧ-1 с целью выявления новых мишеней для создания противовирусных препаратов. Роль клеточного белка Ku в репликации вируса еще не до конца изучена, однако предполагается, что он может участвовать, по крайней мере, в двух стадиях жизненного цикла ВИЧ-1: защите вирусной интегразы (ИН) от протеасомной деградации и активации транскрипции с интегрированного провируса. Еще одной стадией, в которой может участвовать белок Ku, является репарация одноцепочечных разрывов, возникающих в геноме человека после интеграции в него вирусной ДНК. Таким образом, Ku может оказаться очень перспективной мишенью для ингибирования репликации ВИЧ-1. В рамках изучения способности ИН взаимодействовать с компонентами 20S субъединицы ядерной протеасомы мы впервые показали, что ИН в условиях суперэкспрессии в клетках взаимодействует с 20S протеосомой, при этом, предположительно, это взаимодействие локализуется в районе α2 субъединицы. Связывания ИН с α6 субъединицей протеасомы нами не детектировалось. После была получена серия плазмидных эукариотических конструкций, кодирующих делеционные мутанты интегразы (1-160, 1-220, 47-220). Мы провели выделение макромолекулярных комплексов, формируемых ИН, экспрессированной в клетках НЕК 293Т. Было показано, что даже фрагмент ИН 1_160, не содержащий основного сайта узнавания Ku70, способен эффективно соосаждать протеосому. Следовательно, наши результаты показывают, что ассоциация ИН с протеосомой скорее всего не связано с ее взаимодействием с Ku70. Показано, что суперэкспрессия полноразмерного белка Ku70 защищает интегразу от протеасомной деградации при ко-экспрессии обоих белков в клетках HEK 293T. Уменьшение количества Ku70 путем его нок-дауна приводило к соответствующему уменьшению содержания интегразы в клетках. С использованием делеционных мутантов Ku70(1-250 и 250-609) было показало, что на фоне нормального клеточного уровня Ku70 оба домена стабилизируют ИН. При этом на фоне подавленного эндогенного Ku70, стабилизирующего эффекта домена Ku70(250-609) на ИН обнаружено не было. Необходимо отметить, что описанный эффект наблюдался как для полноразмерной ИН, так и для ИН(1-220) и для ИН(1-160). Мы предполагаем, что стабилизирующий эффект оказывает все же N-концевая часть Ku70 (1-250 а.о.), что согласуется с результатами, полученными на очищенных белках. В связи с этим взаимодействие Ku70 с ИН может рассматриваться как потенциальная мишень для создания новых анти-ВИЧ препаратов. Наряду с изучением взаимодействия ИН с 20S-субъединицей протеасомы методом коиммунопреципитации из клеток, мы решили изучить колокализацию 20S-протеасомы с суперэкспрессированной с плазмидного вектора ИН. Оказалось, что суперэкспрессии интеграза ВИЧ-1 и 20S протеасома локализованы как в цитоплазме, так и в ядре (преимущественно). При этом суперэкспрессия интегразы не влияет на локализацию протеасом. При этом примерно половина сигналов от протеасом колокализуются с сигналами от интегразы. Кроме того мы установили, что разные внутриклеточные концентраций Ku70 (условия сниженной, нативной или повышенной экспрессии Ku70) не оказывают значимого влияния на степень колокализации 20S-протеасомы с суперэкспрессированной с плазмидного вектора ИН. В рамках исследований по оценке способности интегразы взаимодействовать с 20S протеасомой в условиях инфекции клеток человека репликативно-некомпетентным вектором на основе ВИЧ-1, нам также удалось детектировать связывание ИН и α2 субъединицы протеосомы. Интересно отметить, что инфекция вирусом приводила к снижению количества Ku70 в клетках HEK 293 T (40-50% снижения), а также в клетках HeLa (на 20-30%). Более того, уровень Ku80 в данном эксперименте тоже снижается. Помимо этого, мы выяснили, что подавление количества Ku70 за счет трансфекции коктейля соответствующих siРНК стимулирует репликацию репликативно-некомпетентного люциферазного вектора на основе ВИЧ-1. Этот результат противоречит данным (Manic et al. PLOS One, 2013), однако отчасти согласуется с данными недавней работы (Hultquist et al. Cell Rep., 2016), в которой показали, что стабильный нок-аут Ku70 в первичных лимфоцитах человека из периферической крови приводит к стимуляции инфекции ВИЧ-1. Следующей задачей данного этапа проекта было продолжение изучения взаимодействия белка Ku с внутренними областями LTR в составе ДНК ВИЧ-1. Для этого двумя независимыми способами была изучена эффективность взаимодействия Ku c комплексами радиоактивно-меченных участков LTR ВИЧ-1: полноразмерный LTR (участок 1-633); LTR, разбитый на две части (участки 1-372 и 355-633); LTR, разбитый на шесть коротких частично-перекрывающихся фрагментов (1-150, 125-272, 241-372, 355-507, 442-568, 492-633), каждый из которых содержал на обоих 5’-концах биотин, со стрептавидином, блокирующим концы ДНК. Было установлено, что гетеродимер Ku с одинаковой эффективностью связывается со всеми ДНК-фрагментами, но при этом в 2 раза хуже, чем с контрольной ДНК, содержащей биотин только на одном из концов. После этого мы изучили взаимодействие гетеродимера Ku, а также белка Ku70, с конструкциями, содерсодержащим внутренний 21-звенный предполагаемый сайт связывания Ku в промоторе MMTV, гомологичный ему участок LTR ВИЧ-1 (238-258), и концевые последовательности, формирующие короткие ДНК-шпильки и 7-звенные дуплексы, с которыми гетеродимер Ku по литературным данным (Walker J.R. et al., Nature, 2001, 412, 607-614) не взаимодействует, а также рядом контрольных ДНК. Оказалось, что гетеродимер Ku и изолированный Ku70 не проявляют сиквенс-специфичности и по отношению к коротким ДНК. Более того, футпринтинг ДНКазой I показал, что взаимодействие с Ku обеспечивается короткими концевыми шпильками, а не внутренними специфическими участками. Таким образом выявленное отсутствие специфичности взаимодействия Кu c внутренними участками ДНК по всей видимости объясняется тем, что в данном случае взаимодействие осуществляется не за счет особенностей ее нуклеотидной последовательности, а из-за элементов вторичной структуры участков ДНК (шпильки, кресты). При этом на уровне одноцепочечных ДНК изолированный Ku70 эффективно связывает участок в промоторе MMTV, но не взаимодействует с участком LTR ВИЧ-1, а также контрольной инвертированной последовательностью. Помимо этого, была предпринята попытка изучения взаимодействия гетеродимера Кu с ДНК методом кросс-линкинга. Для фиксации белка были получены ДНК-дуплексы, содержащие два типа реакционноспособных групп: дитиогруппу и акриламидную группировку на линкерах различной длины. Возможность образования конъюгатов модифицированных ДНК с остатками цистеина в белке была продемонстрирована на модельном белке MutS из E. coli, характер связывания которого с ДНК аналогичен связыванию гетеродимера Кu. Эксперименты с MutS показали, что выходы продуктов реакции с акриламидной группировкой были в среднем в 5 раз ниже, чем с ДНК-дуплексами содержащими пиридилдисульфидную группировку. Поэтому эксперименты с гетеродимером Ku и белком Ku70 проводили с ДНК, содержащими наиболее реакционноспособную пиридилдисульфидную группировку на линкерах различной длины (от 6,8Å до 54,1Å) в середине и на конце ДНК-дуплекса. К сожалению, в виду необходимости проводить кросслинкинг в отсутствие восстановителей меркаптоэтанол, дитиотреит и т.д.) и связанной с этим повышенной агрегацией белков, образования ДНК-белковых конъюгатов зафиксировать не удалось.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 июля 2014 г.-15 декабря 2014 г. | Поиск новых мишеней для ингибирования ВИЧ-1 инфекции: исследование роли клеточного белка Ku в репликации ВИЧ-1 |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта в течение 2014 г. исследования проводились по 4-м основным направлениям: 1. оценка способности суперэкспрессированной интегразы ВИЧ-1 (ИН) взаимодействовать с 20S протеасомой; 2. получение бицистронной плазмидной конструкции для одновременной экспрессии в E.coli компонентов гетеродимера Ku (Ku70 и Ku80) и получение гетеродимерного белка Ku70/Ku80; 3. получение набора модельных ДНК-дуплексов, имеющих структуру различных участков длинных концевых повторов и продуктов интеграции вирусной ДНК в клеточную, концы которых закрыты объемными группировками, и изучение их связывания с белком Ku; 4. получение реакционно-способных производных ДНК и оценка их взаимодействия с ДНК-узнающими белками на модельных системах. | ||
2 | 1 января 2015 г.-15 декабря 2015 г. | Поиск новых мишеней для ингибирования ВИЧ-1 инфекции: исследование роли клеточного белка Ku в репликации ВИЧ-1 |
Результаты этапа: Настоящий проект направлен на исследование влияния белка человека Ku, представляющего собой гетеродимер Ku70/Ku80, на процесс репликации ВИЧ-1 с целью выявления новых мишеней для создания противовирусных препаратов. Роль клеточного белка Ku в репликации вируса еще не до конца изучена, однако предполагается, что он может участвовать, по крайней мере, в двух стадиях жизненного цикла ВИЧ-1: защите вирусной интегразы (ИН) от протеасомной деградации и активации транскрипции с интегрированного провируса. Еще одной стадией, в которой может участвовать белок Ku, является репарация одноцепочечных разрывов, возникающих в геноме человека после интеграции в него вирусной ДНК. Таким образом, Ku может оказаться очень перспективной мишенью для ингибирования репликации ВИЧ-1. В рамках изучения способности ИН взаимодействовать с компонентами 20S субъединицы ядерной протеасомы мы впервые показали, что ИН в условиях суперэкспрессии в клетках взаимодействует с 20S протеосомой, при этом, предположительно, это взаимодействие локализуется в районе α2 субъединицы. Связывания ИН с α6 субъединицей протеасомы нами не детектировалось. В дальнейшем мы планируем выявить домен ИН, непосредственно взаимодействующий с протеасомой. Увеличение экспрессии Ku70 в наших условиях никак не сказалось на соосаждении α2 субъединицы с ИН. Возможно, это обусловлено очень высоким уровнем содержания эндогенногоKu70, поскольку мы обнаружили, что суперэкспрессия Ku70 с кодирующего его вектора приводит лишь к 1.2-кратному увеличению количестваэтого белка в клетке. Вместе с тем, уменьшение количества эндогенного Ku70 в клетке путем его нок-дауна приводит к соответствующему уменьшению количества соосажденной α2 субъединицы. В рамках исследований по оценке способности интегразы взаимодействовать с 20S протеасомой в условиях инфекции клеток человека репликативно-некомпетентным вектором на основе ВИЧ-1, нам также удалось детектировать связывание ИН и α2 субъединицы протеосомы. Интересно отметить, что инфекция вирусом приводила к снижению количества Ku70 в клетках на 40-50%. Это достаточно неожиданный эффект, который требует дальнейшего изучения. Есть данные о том, что для некоторых вирусов, например для вируса осповакцины, DNA-PK и Ku70 участвуют в процессе ДНК-сенсинга и активации внутриклеточного противовирусного иммунитета (PetersN.E. etal., PLOSPathogen, 2013), однако для ВИЧ-1 таких данных до сих пор получено не было. В рамках анализа влияния белка Ku70 на стабильность ИН, мы показали, что суперэкспрессия полноразмерного белка Ku70 защищает интегразу от протеасомной деградации при ко-экспрессии обоих белков в клетках. Уменьшение количества Ku70 путем его нок-дауна приводило к соответствующему уменьшению содержания интегразы в клетках. Эффект не превышал 25%, что хорошо коррелирует с данными о 20%-ом повышении суммарного уровня экспрессии Ku70 при его суперэкспрессии . Также в экспериментах in vitro с рекомбинантными белками мы показали (Anisenko A. et al., FEBS J., 2014), что домена Ku70(1-250) достаточно для формирования стабильного комплекса с интегразой. В этой связи мы решили исследовать, может ли этот домен защищать ИН от протеолитической деградации. Мы получили конструкцию, кодирующую делеционный мутант Ku70(а.к.1-250), а также конструкцию, кодирующую мутант Ku70(250-609). Однако достоверного влияния этих белков на стабильность ИН нам установить не удалось. Возможно, HA-метка, находящаяся С-конце всех наших эукариотических конструкций, кодирующих ИН, влияет на взаимодействие интегразы с делеционными мутантами Ku70 и мешает нам детектировать их эффект на стабильность интегразы в клетке. Мы преступили к созданию конструкций, кодирующих интегразу ВИЧ-1, в которых НА-метка находится на N-конце белка. Еще одной причиной, препятствующей получению достоверных результатов по влиянию делеционных мутантов Ku70 на стабильность интегразы, может быть низкий уровень экспрессии этих белков с плазмиды по сравнению с общим количеством Ku70 в клетках. Таким образом, для достоверного наблюдения за влиянием делеционных мутантов Ku70 на стабильность интегразы в клетках и на ее взаимодействие с протеосомой необходимо будет поставить эксперимент, в котором экспрессия эндогенного Ku70 будет подавлена, а клетки будут котрансфецированы интегразой и делеционным мутантом Ku70. К сожалению, подобранные нами на предыдущем этапе работы siРНК к Ku70 также будут подавлять и экспрессию его делеционного мутанта Ku70(1-250). Таким образом, необходимо подобрать siРНК, комплементарные С-концевой части Ku70, которые не подавляли бы экспрессию Ku70(1-250). Мы предполагаем, что в такой системе мы сможем достоверно детектировать эффект от Ku70 и его делеционных мутантов на стабильность ИН в клетках и на ее взаимодействие с протеосомой. Для увеличения чувствительности детекции мРНК Ku70 методом количественного ПЦР проведено сравнение красителей для выбора оптимального. Для исследования роли белка Ku в транскрипции провируса необходимо было создать модель, которая позволила бы изучать связывание Ku с определенной «внутренней» структурой ДНК, имитирующей интегрированный провирус, и избежать при этом характерного для Ku неспецифического связывания с концами двуцепочечной ДНК. В качестве такой модели на первом этапе выполнения проекта было решено использовать ДНК-дуплексы, концы которых закрыты комплексом биотина со стрептавидином. Методом ПЦР с полноразмерного LTR ВИЧ-1 в присутствии 32P-меченного α-dATP были получены радиоактивно меченные полноразмерный LTR (участок 1-633), а также LTR, разбитый на две части (участки 1-372 и 355-633). Все праймеры имели на 5’-конце (dT)3-спейсер, в котором внутренний тимидин содержал остаток биотина, присоединенный к С5 положению гетероциклического основания посредством линкера, что позволяет закрыть оба конца полученного ПЦР-продукта объемными молекулами стрептавидина. Полученные LTR/стрептавидин комплексы инкубировались с гетеродимером Ku, содержащим 6His-tag на N-конце субъединицы Ku70, а затем иммобилизовались на Ni-NTA-агарозе. В качестве контролей на Ni-NTA-агарозу также наносили участки LTR, обработанные стрептавидином, но без Ku, а также комплекс Ku c радиоактивно-меченым 21-звенным участком U5 LTR со свободными концами. Оказалось, что при инкубации Ku c тремя полученными комплексами LTR/стрептавидин во всех случаях на смоле остается связанной порядка 30% ДНК. Тогда как в отсутствие Ku на смоле детектируется не более чем 3%-ное неспецифическое осаждение ДНК. В случае 21-звенного участка U5 LTR со свободными концами эффективность соосаждения Ku и ДНК составила порядка 60%. Таким образом, нами впервые в экспериментах с рекомбинантным препаратом Ku была продемонстрирована его способность связываться с внутренними участками ДНК. В дальнейшем мы планируем разбить последовательность LTR на шесть частично перекрывающихся участков: 1-150, 125-272, 241-372, 355-507, 442-568, 492-633 для того, чтобы точно установить те, которые Ku будет связывать наиболее эффективно. Возможность сиквенс-специфичного связывания Ku с внутренними областями ДНК предполагается в ряде работ (Giffin W.etal., J.Biol. Chem. 1997,272,5647-5658;GiffinW.etal., Nature,1996,380, 265-268), однако четких эксперименальных подтверждений этого до сих пор получено не было. Мы решили экспериментально проверить возможность связывания рекомбинантного Ku c короткими (порядка 20 звеньев) ДНК с «закрытыми» концами. В качестве модели такой ДНК была выбрана составная конструкция, содержащая внутренний 21-звенный предполагаемый сайт связывания Ku в промоторе GR-штамма вируса MMTV (mouse mammary tumor virus) (Giffinetal., JBiolChem, 1997, 272(9), 5647-5658) и концевые последовательностями, формирующие короткие ДНК-шпильки и 7-звенные дуплексы, с которыми гетеродимер Ku по данным работы (WalkerJ.R., Nature, 2001, 412, 607-614) не взаимодействует. Нами был проведен дизайн и синтез олигонуклеотидов, из которых формировали необходимую структуру. Методом торможения в геле было изучено взаимодействия такой ДНК с гетеродимером Ku. В качестве контроля использовали 21-звенный участок U5 LTR со свободными концами. Оказалось, что Ku эффективно связывает не только ДНК со свободными концами, но и изучаемую составную конструкцию. На следующем этапе мы планируем получить конструкции подобной структуры, содержащие различные внутренние участки из LTR ВИЧ-1, а также контрольные "случайные" последовательности ДНК. Ковалентное специфичное присоединение белков к ДНК (кросс-линкинг) позволяет не только изучать детали НК-белковых взаимодействий, но и понять особенности функционирования сложных динамических белковых ансамблей, взаимодействующих с ДНК, за счет фиксации одного из компонентов на нуклеиновой кислоте. В этой связи было решено использовать этот метод для более детального исследования взаимодействия Ku с ДНК. Для отработки условий реакции в качестве модельного объекта исследования был выбран белок MutS из E coli. Как и белок Ku, белок MutS является участником системы репарации ДНК в клетке. Оба белка (Ku и MutS) кольцом обвиваются вокруг ДНК-дуплекса, но при этом не взаимодействуют с основаниями ДНК, а образуют несколько контактов с углеводофосфатным остовом, поэтому использование MutS в качестве модельного белка являлось правомерным. Синтезированы 3'-амидофосфитные производные 2'-дезоксиуридина с терминальной этинильной группировкой, присоединенной к С5-атому урацила с помощью линкеров различной длины, и олигодезоксирибонуклеотиды с включениями данных модифицированных звеньев – предшественники химически активных фрагментов ДНК. С высокими выходами получена серия ДНК, содержащих акриламидную группировку, которые были успешно использованы для аффинной модификации белка системы репарации неканонических пар нуклеотидов – MutS. Показано, что реакция кросслинкинга эффективна, региоселективна и специфична и может быть рекомендована для зондирования ДНК-белковых контактов в комплексе Ku с ДНК. В экспериментах на модельной системе также установлено, что для изучения окружения остатка цистеина в комплексах гетеродимерных белков с ДНК удобно использовать метод «фотосшивки» ДНК-белкового комплекса с помощью бифункционального фотоактивируемого реагента 4-(N-малеимидо)бензофенона. Одним из наиболее частых повреждений ДНК является окисление двойной связи тимидина с образованием 5,6-дигидро-5,6-дигидрокситимидина (тимидингликоля, Tg). Удаление Tg приводит к образованию апуриновых сайтов, в репарации которых важную роль играет гетеродимер Ku (Kosova AA. et al., Mol Biol (Mosk). 2015, 49(1), 67-74). Нами был осуществлен синтез модифицированных фрагментов ДНК с остатком тимидингликоля в различных положениях олигонуклеотидной цепи, с использованием которых впервые обнаружено влияние Tg на взаимодействие ДНК с фактором транскрипции NF-карраВ. Установлено, что эффективность связывания NF-κB с модифицированными дуплексами зависит от субъединичного состава белка, от положения тимидингликоля и его нуклеотидного окружения в κB-участке. Сродство субъединицы p65 к Tg-содержащим ДНК значительно ниже по сравнению с субъединицей р50. | ||
3 | 1 января 2016 г.-15 декабря 2016 г. | Поиск новых мишеней для ингибирования ВИЧ-1 инфекции: исследование роли клеточного белка Ku в репликации ВИЧ-1 |
Результаты этапа: 1. Исследования соосаждения различных делеционных мутантов ИН (1-160, 1-220 и 47-220) с α2-субъединицей протеасомы показали, что с протеасомой взаимодействует участок каталитического домена ИН (47-160), таким образом ассоциация ИН с протеасомой по всей видимости не связана с ее взаимодействием с Ku70. 2. Было установлено, что разные внутриклеточные концентраций Ku70 (условия сниженной, нативной или повышенной экспрессии Ku70) не оказывают значимого влияния на степень колокализации 20S-протеасомы с суперэкспрессированной с плазмидного вектора ИН, которая во всех случаях лежит в диапазоне 40-60%. 3. Изучение влияния стабилизирующего действия делеционных мутантов Ku70(1-250) и Ku70(250-609) на ИН при суперэкспрессии показало, что на фоне нормального клеточного уровня Ku70 оба домена стабилизируют ИН. При этом на фоне подавленного эндогенного Ku70, стабилизирующего эффекта домена Ku70(250-609) на ИН обнаружено не было. Эти результаты, совместно с данными, полученными ранее при суперэкспрессии полноразмерного Ku70, а также на очищенных белкам, по всей видимости, указывают на то, что стабилизирующий эффект на ИН оказывает N-концевая часть Ku70 (1-250 а.о.), взаимодействие которой с ИН может рассматриваться как потенциальная мишень для создания новых анти-ВИЧ препаратов. 4. В рамках изучения роли Ku на начальных этапах репликации ВИЧ было установлено, что уровень Ku70 несколько снижается (на 20-30%) в клетках HeLa, инфицированных репликативно-некомпетентным вектором на основе ВИЧ-1, таким образом подтвердив полученные нами ранее данные на клетках другой линии HEK 293T. Более того, уровень Ku80 в данном эксперименте тоже снижается. Помимо этого, мы выяснили, что подавление количества Ku70 за счет трансфекции коктейля соответствующих siРНК стимулирует репликацию репликативно-некомпетентного люциферазного вектора на основе ВИЧ-1. 5. Для исследования способности гетеродимера Ku взаимодействовать c внутренними областями ДНК были получены комплексы радиоактивно-меченных участков LTR ВИЧ-1 (1-150, 125-272, 241-372, 355-507, 442-568, 492-633), содержащих на 5’-концах биотин, со стрептавидином, блокирующим концы ДНК. Инкубация комплексов LTR/стрептавидин с различными концентрациями гетеродимера His6-Ku70/Ku80 с последующим осаждением на Ni-NTA-агарозе позволила установить, что гетеродимер Ku с одинаковой эффективностью связывается со всеми ДНК-фрагментами, но при этом в 2 раза хуже, чем с контрольной ДНК, содержащей биотин только на одном из концов. Эти результаты были подтверждены в обратном эксперименте, когда биотинилированные ДНК осаждали на стрептавидин-сефарозе, обрабатывали избытком стрептавидина, а затем инкубировали с Ku. Было изучено взаимодействие гетеродимера Ku, а также белка Ku70, с конструкциями, содерсодержащим внутренний 21-звенный предполагаемый сайт связывания Ku в промоторе MMTV, гомологичный ему участок LTR ВИЧ-1 (238-258), и концевые последовательности, формирующие короткие ДНК-шпильки и 7-звенные дуплексы, с которыми гетеродимер Ku по литературным данным не взаимодействует, а также рядом контрольных ДНК. Оказалось, что гетеродимер Ku и изолированный Ku70 не проявляют сиквенс-специфичности и по отношению к коротким ДНК. Более того, футпринтинг ДНКазой I показал, что взаимодействие с Ku обеспечивается короткими концевыми шпильками, а не внутренними специфическими участками. При этом на уровне одноцепочечных ДНК изолированный Ku70 эффективно связывает участок в промоторе MMTV, в то время как практически не взаимодействует с участком LTR ВИЧ-1, а также контрольной инвертированной последовательностью. 6. С целью изучения взаимодействия гетеродимера Кu с ДНК методом кросс-линкинга, были синтезированы модифичированные ДНК-дуплексы, содержащие два типа реакционноспособных групп: дитиогруппу и акриламидную группировку на линкерах различной длины. К сожалению, в виду необходимости проводить кросслинкинг в отсутствие восстановителей и повышенной агрегации белков, образования ДНК-белковых конъюгатов зафиксировано не было. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".