ИСТИНА

Проектом предусматривается разработка принципов получения и изучение свойств новых структурных аналогов иммунногенных пептидов проламинов как инструментов направленного поиска и контроля ферментов, необходимых для развития подходов к лечению аутоиммунных заболеваний, в частности, целиакии. Основной целью проекта является создание комплекса коротких, но разнообразных по структуре фрагментов и аналогов иммунногенных пептидов и разработке на их основе высокоспецифичных субстратов, ингибиторов и пептидных лигандов пролин- и глутаминрасщепляющих ферментов. Концепция, положенная в основу этого проекта, позволяет применить для получения новых структурных аналогов иммуногенных пептидов общую методологию синтеза пептидов, включая химико-энзиматические подходы, и создает предпосылки для установления общих закономерностей связи между химической структурой и биологической активностью фрагментов и аналогов иммуногенных пептидов проламинов.

Проведен дизайн и осуществлен препаративный синтез окта- и декапептидов и их флуорогенных аналогов с внутренним тушением флуоресценции -т.н. FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-пептидов, являющихся фрагментами известных иммуногенных эпитопов ?-5 – и ?-2-глиадинов (проламинов пшеницы): QPQQPFPQ (I), LPYPQPQLPQ (II), Abz-QPQQPFPQ-EDDnp (III), Abz-LPYPQPQLPQ-EDDnp (IV).Изучена биологическая активность полученных FRET-пептидов в отношении возможности их гидролиза широким кругом пептидаз различных кланов. Показана устойчивость пептидов к действию большинства протеолитических ферментов с широкой субстратной специфичностью. Установлено, что синтезированные соединения расщепляются только некоторыми цистеиновыми пептидазами семейства папаина, причем с наибольшей эффективностью – катепсинами L из насекомых вредителей семейства тенебрионидов, для которых проламины являются естественными пищевыми субстратами. Проведен дизайн и синтезированы высокоэффективные и селективные хромогенные и флуорогенные пептидные субстраты глутамин- и пролинспецифичных пептидаз, а также ингибиторы пролин-расщеплящих ферментов. Структура синтезированных субстратов может быть выражена общей формулой A-Хаа-Yaa?B, где А = Glp (пироглутамил), HBr, Z (бензилоксикарбонил); Xаа =Ala, Ala-Ala, Gly, Gly-Gly, Pro, Phe, Val, Yаа=Pro, Yaa2; В = pNA (п-нитроанилид), AMC (7-амидо-4-метилкумарин), ?NA (?-нафтиламин); место предполагаемого гидролиза субстратов показано стрелкой. Присутствие в структуре субстратов п-нитроанилидной группы обеспечивает простоту и точность контроля ферментативной активности по измерению поглощения п-нитроанилина. Использование флуорогенных группировок позволяет на порядок повысить чувствительность измерений. В качестве ингибиторов синтезированы производные Pro и Ile, содержащие на С-конце остатки циклических аминов – пиперидина (Pip), морфолина (Mf), имидазола (Im). Показана применимость полученных пептидомиметиков для продуктивного и целенаправленного скрининга пролин-и глутаминрасщепляющих пептидаз как в индивидуальном состоянии, так и в составе многокомпонентных ферментных смесей. Полученный набор «пептидных инструментов» был с успехом использован для поиска, выделения, идентификации и характеристики пролилкарбоксипептидазы из T.molitor - первой обнаруженной секретируемой пищеварительной карбоксипептидазы насекомого. Ингибирующее действие Pro-Pip (Mf, Im) и Ile-Pip (Mf, Im) проверяли на сложной мультиферментной смеси из пищеварительного комплекса личинок Tenebrio molitor и на коммерческом препарате ?-химотрипсина быка. Показано, что синтезированные соединения совсем не ингибируют цистеиновые пептидазы, практически не влияют на химотрипсиновые и являются специфичными ингибиторами, как мы и предполагали, лишь для пролинрасщепляющих ферментов. Проведен синтез аффинного сорбента на основе иммуногенного эпитопа пептидов проламинов и исследована его применимость для биоспецифической хроматографии пролин- и глутаминспецифичных пептидаз в составе многокомпонентных природных комплексов. Показана применимость синтезированных соединений для постэлектрофоретической детекции пролин- и глутаминспецифичных пептидаз. Предложенные и синтезированные в ходе выполнения проекта субстраты, ингибиторы и аффинные сорбенты составляют уникальный комплекс пептидных инструментов, позволяющий существенно повысить эффективность целенаправленного и продуктивного скрининга ферментов, способных расщеплять иммуногенные эпитопы проламинов.