ИСТИНА

Рибосомные РНК кишечной палочки содержат 36 нуклеотидов, каждый их которых модифицирован с помощью индивидуального фермента. Все модифицированные нуклеотиды располагаются в функционально значимых центрах рибосомы, поэтому нет сомнений в том, что процесс модификации каждого нуклеотида является важным для клетки. Удивительным является тот факт, что роль большинства модифицированных нуклеотидов бактериальных рРНК до сих пор остается загадкой: известно лишь, что некоторые модификации могут быть важны для структурообразования рРНК, а некоторые обеспечивают устойчивость к определенным антибиотикам. Для того, чтобы понять, какую роль в клетке выполняет модификация, необходимо сперва выяснить, какой фермент отвечает за ее возникновение. В последние годы список рРНК-модифицирующих ферментов кишечной палочки стремительно пополнился, и из 36 осталось всего три модифицированных нуклеотида, для которых соответствующие ферменты так и не обнаружены: m6A2030, D2449 и ho5C2501. Данный проект был направлен на поиск ферментов Escherichia coli, отвечающих за метилирование нуклеотида А2030 23S рРНК по 6 положению, и за дигидроуридинилирование нуклеотида 2449 23S рРНК. Поиск произведен с использованием уникального метода обнаружения модифицированных нуклеотидов путем плавления рРНК-ДНК дуплексов, разработанного членами заявленного авторского коллектива. В рамках проекта произведена оценка влияния каждой из исследуемых модификаций 23S рРНК на функционирование рибосомы и клетки в целом.

На момент начала проекта не было информации о трёх ферментах, модифицирующих рибосомную РНК кишечной палочки, которые ответственны за формирование модификаций m6А2030, D2449 и ho5C2501 в 23S рРНК. Мы поставили перед собой задачу идентифицировать два из трёх оставшихся фермента: метилтрансферазу, метилирующую нуклеотид А2030 до m6А, и дигидроуридинсинтазу, восстанавливающую нуклеотид U2449 до D. Кроме того, нас интересовала роль данных модификаций в жизнедеятельности клетки. Мы получили следующие результаты. В ходе выполнения проекта была успешно идентифицирована рРНК-метилтрансфераза YhiR, которая специфически метилирует нуклеотид А2030 23S рРНК E. coli. Первичный поиск гена, кодирующего искомую рРНК-метилтрансферазу, производили среди 17 кандидатов, бОльшая часть из которых не была аннотирована. Мы, в том числе, решили проверить модифицирующую активность тех ферментов, которые, как уже было известно, формируют m6А в различных типах РНК E. coli. Трудность проверки модифицирующей активности m6А-метилтрансфераз заключалась в том, что не было адекватных методов проверки наличия/отсутствия метильной группы на экзоциклическом атоме азота в аденине. Приступая к выполнению данного проекта, мы уже завершали разработку нового метода для быстрого и удобного сравнения m6А и А (метилированного и неметилированного аденозина в 6 положении) в составе РНК. Как мы показали, кривые плавления для метилированных и неметилированных могут заметно отличаться. Благодаря этому, нам удалось быстро установить, какой из 17 генов может быть ответственен за метилирование нуклеотида А2030 в 23S рРНК E. coli. Используя очевидное различие в кривых плавления для рРНК из нокаутного штамма ?yhiR и для рРНК из других штаммов (рис. 1), мы приступили к проверке ферментативной активности белка YhiR. Мы показали, что ген yhiR действительно является необходимым и достаточным для модификации нуклеотида А2030 в 23S рРНК. Кроме того, мы установили, что фермент наиболее активен по отношению к 23S рРНК на первой стадии самосборки рибосомы, т.е. посттранкрипционно. При сравнении жизнеспособности клеток дикого типа и клеток, лишённых гена yhiR (а значит, и модификации), мы не обнаружили заметных различий при изменении условий культивации, а также при конкурентном росте двух штаммов в одной пробирке. Это, по всей видимости, указывает на то, что метилирование нуклеотида А2030 необходимо в особых для клетки условиях, которые сложно предсказать. Для идентификации дигидроуридинсинтазы, которая восстанавливает U2449 в 23S рРНК, мы, в первую очередь, решили проверить, не является ли данный нуклеотид дополнительным субстратом для одной из трёх уже аннотированных дигидроуридинсинтаз: DusA, DusB, DusC (Bishop AC, Xu J, Johnson RC, Schimmel P, de Crecy-Lagard V. Identification of the tRNA-dihydrouridine synthase family. J Biol Chem. 2002. 277(28):25090-5), т.к. ни одного нового гомолога дигидроуридинсинтаз в геноме E. coli найти не удаётся. Оказалось, что при удалении каждого из генов dusA, dusB, dusC модификация D2449 сохраняется (рис. 2). В связи с этим мы решили проверить, не могут ли ферменты заменять друг друга в отсутствие одного или сразу двух других? После многочисленных попыток получить нокаутные штаммы ?dusA, ?dusB, ?dusC c заменой гена на ген устойчивости к различным антибиотикам, такие штаммы нам любезно предоставил проф. А. Бишоп. Это позволило нам получить, в свою очередь, нокаутные штаммы, в каждом из которых удалены попарно по 2 гена. В настоящий момент проводится проверка изложенной гипотезы о “сотрудничестве” ферментов при модификации нуклеотида 2449 23S рРНК E. coli.