ИСТИНА

Расстройства поведения связанного с приёмом пищи - относящаяся к психическим расстройствам группа синдромов в МКБ-10 с сильно различающимся содержанием: от способного самопроизвольно прекратиться переедания, до нервной анорексии (F50.0), смертность при которой достигает 15%. Многие исследователи связывают возникновение нервной анорексии с нарушением захвата серотонина, а также с отклонением в функционировании периферийных механизмов насыщения. Выделенный в 2006г. Masatomo Mori с соавт. фрагмент высококонсервативного белка NUCB2, получивший название несфатин-1, необходим для распознавания голода и насыщения в мозге крысы. Показано, что избыток несфатина-1 в мозге приводит к потере аппетита, чувству насыщения, а также к уменьшению массы тела. Недостаток несфатина-1 приводит к обратным эффектам. Иммуногистохимически показана колокализация несфатина-1 с серотонином и холецистокинином в ЦНС, также показан больший уровень несфатина в плазме больных, страдающих генерализированной депрессией. Все это позволяет предположить влияние пептида именно на психическую составляющую нарушений пищевого поведения. Можно также прогнозировать, что длительное снижение эндогенного уровня несфатина-1 может оказывать положительное влияние на течение рецидивирующей нервной анорексии и предотвращать переход болезни в терминальную кахектическую стадию. В проекте планируется синтез активной субъединицы несфатина-1, сравнительное изучение пищевого и эмоционального поведения животных (белых крыс), как при прямом введении пептида, так и при снижении его эндогенного уровня с помощью метода инверсной иммунорегуляции, т.е. активной иммунизации животных синтезированным ковалентным конъюгатом несфатина-1 с антигеном-носителем с соответствующим иммунологическим и биохимическим анализом. Для решения основной задачи и уточнения физиологических эффектов несфатина-1 планирeтся in silico поиск и изучение экспрессионных мишеней несфатина-1 с привлечением молекулярно-генетических методов (ОТ-ПЦР в режиме реального времени). Перспектива работы состоит в формировании нового фундаментального подхода к длительной коррекции нарушений пищевого поведения.

В ходе выполнения Проекта: 1. Впервые проведена работа по биоинформационному поиску активных участков белка несфатин-1 и синтез пептидов-фрагментов несфатина-1, которые, по нашим данным, могли бы обладать функциональной активностью. 2. Впервые проведены поведенческие исследования с парентеральным введением синтезированных нами пептидов Nesf-27, Nesf-27с, Nesf-18 и Nesf-8с использованием разных доз и сроков тестирования. Показано, что профиль поведенческих эффектов пептидов согласуется с данными литературы о воздействии самого несфатина-1. 3. Проведено определение содержания катехоламинов в стриатуме самцов и самок крыс после курсового введения Nesf-27с, Nesf-18, Nesf-8. Для всех синтезированных пептидов показано увеличение содержания норадреналина и снижение содержания дофамина и его метаболитов, носящее сходную направленность, но отличающееся по степени выраженности, что согласуется с данными литературы для эндогенного пептида (Li et al., 2014). 4. Впервые выявлен минимальный фрагмент несфатина-1, обладающий функциональной активностью – пептид Nesf18. С помощью теста «крестообразный приподнятый лабиринт», теста Порсольта и ночной видеофиксации пищевого поведения крыс продемонстрированы его продеперессивные и анорексиогенные эффекты при однократном и курсовом введении. Филогенетическая консервативность данного участка позволяет значительно расширить круг возможных животных-моделей для изучения эффектов пептида. 5. Впервые показано, что снижение уровня эндогенного несфатина-1при помощи активной иммунизаци к пептидам – его синтетическим аналогам оказывает нормализующее орексиогенное, анксиолитическое и противодерпрессивное действие у крыс со сформированным пищевым расстройством в использованных поведенческих тестах. Титр антител составил 1:3200. Полученные результаты подтверждают роль эндогенного несфатина-1 в развитии пищевых и депрессивных нарушений и открывают возможность разработки новых подходов и лекарственных средств для терапии нарушений пищевого поведения. 6. Впервые получены данные о разнонаправленном действии синтетического аналога несфатина-1 на поведение животных разного пола при курсовом парентеральном введении в поведенческих тестах «крестообразный приподнятый лабиринт» и тесте Порсольта. 7. На биохимическом уровне впервые выявлены гендерные различия в действии пептидов: после курсового введения в стриатуме крыс была показана преимущественная активация внутриклеточного ДОФУК-опосредованного пути расщепления дофамина у самок, выражающаяся в увеличении соотношения ДОФУК/ДА и снижении соотношения 3МТ/ДА, и активация 3МТ-пути у самцов, что может быть причиной последующей активации различных сигнальных каскадов. 8. Впервые показано, что в качестве экспрессионных мишеней несфатина-1 выступают гормоны, регулирующие репродуктивную систему: гонадотропин-рилизинг-гормон и лютеинизи́рующий гормо́н, продемонстрировано, что курсовое введение аналогов несфатина-1 у самок вызывает статистически значимое увеличение транскрипционной активности генов Gnrh1 и Lhb, кодирующих предшественники гормонов, что в перспективе может помочь объяснить гендерные различия при нарушениях пищевого поведения. 9. Также впервые показано, что экспрессионной мишенью несфатина-1 у крыс является белок Kiss1, который, в свою очередь активирует экспрессию половых гормонов. Продемонстрировано, что курсовое введение аналогоа несфатина-1 Nesf-27c вызывает статистически значимое увеличение транскрипционной активности гена Kiss1 в гипоталамусе и тонком кишечнике у самок и в гипоталамусе, но не в тонком кишечнике у самцов. 10. Впервые продемонстрировано, что несфатин-1 может являться модулятором эффектов холецистокининергической системы в регуляции пищевого поведения и его эмоциональной составляющей: анализ транскрипционной активности препрохолецистокинина (CCK) в гипоталамусе и тонком кишечнике самцов и самок белых крыс показал статистически значимое увеличение мРНК гена CCK после курсового введения синтетических аналогов белка несфатин-1. По результатам исполнения Проекта подготовлены квалификационные работы: "Оценка уровня транскрипционной активности экспрессионных мишеней белка Несфатин-1 при внутрибрюшинном введении его синтетических аналогов белым крысам". Научные руководители: Климов Евгений Александрович, Рудько Ольга Игоревна, автор: Шипилова Алена Андреевна (Бакалавр), 2015г. "Эффекты прямого введения синтетических фрагментов несфатина-1 на поведение белых крыс". Научный руководитель: Рудько О.И., автор: Скобелева Валерия Михайловна (Специалист) , 2014г. "Оценка роли синтетических фрагментов несфатина-1 в регуляции пищевого поведения белых крыс" Научный руководитель: Рудько О.И. автор: Тарасова Александра Юрьевна (Специалист), 2014г.