ИСТИНА

Главная цель проекта 2025, как и проекта 2021 - изучение строения и структуры, механизмов наследования и скорости эволюции митохондриальных геномов морских арктических беспозвоночных. Актуальность этого исследования, его научная значимость и масштабность вытекают из необходимости оперативного мониторинга состояния экосистем морей Арктики.

на английском языке The main goal of the 2025 project, like the 2021 project, is to study the structure and composition, inheritance mechanisms and evolution rate of mitochondrial genomes of Arctic marine invertebrates. The relevance of this study, its scientific significance and scale stem from the need for operational monitoring of the state of Arctic sea ecosystems

процессе выполнения Проекта 2021 нами была отработана методика секвенирования полных митохондриальных геномов. На первом этапе проводится секвенирование библиотек тотальной ДНК на платформе Illumina (Hiseq 4000 или MiSeq – предоставляемых ОИ) и сборка полученных контигов. В случае, если покрытие оказывается недостаточным для сборки митохондриального генома, то на основе собранных контигов (полученных с использованием референсных митогеномов близкородственнных видов) проводится конструирование праймеров для Long Range PCR. Проведение ПЦР с такими праймерами приводит к значительному обогащению образца митохондриальными последовательностями и позволяет улучшить качество сборки. Если же изначальный подход не позволяет собрать даже частичные митохондриальные геномы, то проводится секвенирование на платформе Oxford Nanopore Technologies (предоставляемых ОИ), а также транскриптомный анализ (RNA-seq) с использованием Illumina Hiseq 4000 или MiSeq, предоставляемых ОИ. Данная стратегия позволяет добиться значительного прогресса в сборках митохондриальных геномов, которые не удавалось собрать ранее. 2025 г. Работа будет проводиться по трем направлениям. 1. Получение последовательностей митохондриальных маркеров для арктических морских беспозвоночных, для которых их не удалось получить ранее. Создание таксонспецифичных праймеров для баркодинга. Несмотря на активные работы в области баркодинга арктической фауны, информация о последовательностях митохондриальных маркеров для представителей многих таксонов в базах данных IBOL и GenBank или ошибочна, или отсутствует. В процессе выполнения Проекта 2021 нами были предприняты попытки отсеквенировать СО1 для более чем 100 видов морских беспозвоночных. Во многих случаях наши усилия не увенчались успехом, так как использование стандартных праймеров не приводило к амплификации целевого продукта (амплифицировать фрагмент не удавалось или в результате амплификации и последующего секвенирования мы получали псевдоген). В таких случаях мы проводили работы по определению последовательности, сборке и аннотации мт-генома с последующим написанием праймеров на СО1 и 16S. 1.1. Микротурбеллярии из рода Monocelis (Platyhelminthes, Proceriata). Вариативность окраски беломорских представителей рода Monocelis натолкнула на мысль о более широком видовом разнообразии, чем отмечено в литературе (2 вида для окрестностей ББС). Один из видов, определяемых в Белом море, M. lineata, по последним данным считается комплексным. Нами было проведено морфологическое и генетическое исследование микротурбеллярий, относящихся к роду Monocelis. Были выделены 5 морф, имеющих различия по окраске. Молекулярно-генетический анализ показал, что окрашенные по-разному (черные, рыжие, белые, молочные и с полоской) моноцелисы имеют значительные различия по последовательностям фрагментов генов 28S и 18S рРНК. На основании этого нашей коллегой, зоологом, участницей проекта, были выделены пять отдельных групп, названных espresso, karanii, cappuccino, honey и mokko. Известные из литературы праймеры для амплификации фрагментов СО1 не подходили для изучаемых объектов. В целях создания праймеров для баркодинга был отсеквенирован, собран и аннотирован мт-геном представителя морфогруппы karanii. На основании анализа полученных последовательностей были созданы праймеры для баркодинга. Однако применение этих праймеров оказалось успешным только для представителей морфогруппы karanii, для других морф получить ПЦР-продукт с использованием этих праймеров не удалось. Поэтому было принято решение секвенировать геномы представителей еще двух морфогрупп: cappuccino и mokko. Попытка получения мт-контигов секвенированием c низким покрытием с последующим картированием на референсный, ранее собранный мт-геном karanii, не удалась, что показывает наличие значительных различий между митогеномами представителей разных морф. Надо при этом заметить, что эти морфы даже не описаны еще как разные виды. Мы предполагаем получить, собрать и аннотировать митогеномы представителей беломорских микротурбеллярий рода Monocelis, а также на основании полученных последовательностей мт-геномов создать праймеры для баркодинга представителей этого рода беломорских микротурбеллярий. По результатам этой работы предполагается подать в печать статью. 1.2. Аналогичная картина наблюдалась для представителей семейства Cossuridae – Cossura pygodactylata (Annelida, Polyсhaeta). В процессе выполнения Проекта 2021 был получен полный митогеном C. pygodactylata. На основе полученной сборки были написаны праймеры для амплификации СO1 и 16S коссурид, а именно: Cossura longocirrata (Баренцево море), Cossura sp. (Карское море, Норвежское море, море Лаптевых), Cossura sp. (Атлантический океан, побережье Габона), Cossura sp. (Индийский океан), Cossura sp. (Тихий океан, Курило-Камчатский желоб), Cossura sp. (Охотское море). Однако получить последовательность СО1 удалось только для C.рygodactylata, во всех других случаях амплификация с этими праймерами не дала желаемых результатов. Мы предполагаем, что мт-геномы видов рода Cossura, единственного рода семейства Cossuridae, имеют значительные различия. Для выяснения этого вопроса, а также подбора праймеров для баркодинга представителей этого семейства, мы предполагаем отсеквенировать, собрать и аннотировать мт-геномы еще нескольких представителей этого семейства, провести их сравнение между собой и на основании этого написать праймеры для баркодинга коссурид. 1.3. Chitinopoma serrula (Annelida, Serpulidae). Представители семейства Serpulidae, по литературным данным (Kupriyanova et al, 2023), имеют сильно увеличенный размер митохондриального генома (порядка 24 000 п.о.) и не имеют праймеров для амплификации митохондриальных маркеров. При выполнении Проекта 2021 для представителя этого вида, обитающего в Белом море, был получен контиг длиной 24785 нуклеотидов. На данный момент мы не можем точно оценить длину оставшегося непрочитанным фрагмента, однако максимальная длина митохондриального генома у видов семейства Serpulidae, чьи геномы представлены в базе данных GenBank, составляет 25087 нуклеотидов (Hydroides minax). Это позволяет предположить, что отсутствует достаточно короткий фрагмент между генами ATP6 и NAD3. Также мы предполагаем, что в этом фрагменте может располагаться ген ATP8. Этот контиг содержит длинный некодирующий участок длиной ~4000 п.н. Некоторые особенности сборки свидетельствуют о наличии повторов, однако без дополнительных данных (секвенирования длинных прочтений) понять, какова на самом деле длина данного участка, не представляется возможным. В 2025 г. мы предполагаем секвенирование на платформе Oxford Nanopore Technologies (предоставляемой ОИ) с последующей сборкой полного мт-генома. По результатам этой работы предполагается публикация статьи. 1.4. Голопелагические полихеты – экологическая группа, объединяющая в себе несколько небольших семейств Errantia, которые проводят в толще воды все стадии своего жизненного цикла и являются важным компонентом пищевых цепей в пелагических экосистемах мирового океана. Известно около 140 видов из шести голопелагических семейств: Lopadorrhynchidae, Iospilidae, Pontodoridae, Tomopteridae, Typhloscolecidae, Yndolaciidae и подсемейства Alciopini (Phyllodocidae). Всех их относят к отряду Phyllodociformiа, наиболее базальным Errantia, и почти все из них, имея характерные морфологические адаптации к жизни в толще воды, сохраняют внешнее сходство с донными филлодоцидами. Несмотря на то, что для некоторых из них получены последовательности СО1 и 16S, ни для одной из полученных последовательностей нет уверенности, что она не является последовательностью псевдогена митохондриального происхождения. При выполнении Проекта 2021 мы сделали попытки секвенировать мт-геномы Pelagobia longicirrata, Maupasia coeca (Annelida, Lopadorhynchidae), Vanadis antarctica (Annelida, Phyllodocidae) и Typholoscolex muelleri (Annelida, Typhloscolecidae). Во всех случаях, кроме М. coeca, нам удалось собрать длинные контиги, содержащие все или почти все митохондриальные гены, но их последовательности (в частности, последовательности СО1) не имели (или имели очень низкий процент) гомологии с последовательностями СО1 полихет. Из полученных данных нам пришлось сделать вывод о том, что из-за высокой насыщенности геномов этих полихет псевдогенами митохондриального происхождения (видимо, в результате псевдогенизации целых мт-геномов) нами был отсеквенирован и собран мт-псевдогеном. И в случае ванадиса, и в случае тифолосколекса нам удалось получить образцы, зафиксированные в RNALater и отсеквенировать транскриптомы этих червей. Мы предполагаем проведение анализа данных этого секвенирования и, на основании этого, получение последовательностей, сборок и аннотаций мт-геномов этих полихет. 1.5. Spio armata (Annelida, Spionidae). В процессе выполнения Проекта 2021 нами был собран и аннотирован мт-геном другой полихеты из семейства Spionidae, подсемейства Polydorini Polydora cf. ciliata. В этом мт-геноме мы идентифицировали и провели сравнительный анализ ORFанов — участков митохондриального генома, предположительно представляющих собой белок-кодирующие гены. Проведя исследование других доступных в генбанке мт-геномов спионид, мы обнаружили три ORFана у пяти видов спионид, причем их появление совпало со значительным изменением архитектуры мтДНК. В то же время, у других спионид (Lindaspio sp. и Marenzelleria neglecta) не наблюдалось ни перестроек, ни ORFанов. Чтобы с большей точностью оценить, насколько связаны изменение геномной архитектуры и появление ORFанов, мы решили секвенировать и собрать митохондриальный геном Spio armata. Эта спионида является внешней группой для представителей родов Polydora и Bocardiella, в митохондриальных геномах которых обнаружены ORFаны, однако, согласно последовательностям маркерных генов, ближе к ним, чем Lindaspio sp. и Marenzelleria neglecta, в которых ORFаны отсутствуют. Мы предполагаем провести верификацию некоторых участков нашей сборки с применением секвенирования по Сэнгеру и, по завершению этой проверки, депонировать собранный мт-геном в базу данных GenBank. По результатам этой работы предполагается подготовить статью к публикации. 2. Подробное изучение обнаруженного нами случая митохондриальной интрогрессии между Calanus simillimus и Calanus propinquus. В процессе выполнения Проекта 2021 нами было обнаружено, что образцы, определенные по морфологическим критериям (а также по последовательностям ядерных генов, таких как гены 18 и 28S рРНК) как C. propinquus, имеют мт-геном, соответствующий C. simillimus. Из шести исследованных нами образцов C. propinquus четыре содержали мт-геном C. simillimus. При попытке отсеквенировать геном C. propinquus нам удалось получить единый контиг длиной 25276 нуклеотидов, что составляет примерно 90 % генома C. simillimus. В настоящее время нами получено еще 9 образцов C. propinquus. Мы надеемся закончить секвенирование мт-генома и провести сравнение геномов этих двух видов. 3. Известно довольно большое число видов двустворчатых моллюсков с так называемым двойным монородительским наследованием мтДНК. Самцы и самки этих видов передают по наследству два варианта сильно дивергировавших митохондриальных геномов. При выполнении Проекта 2021 нами были выбраны представители базальной группы двустворчатых моллюсков – первичножаберные (Bivalvia, Protobranchia) Yoldia hyperborea и Nuculana pernula. Были отсеквенированы, собраны и проаннотированы мт-геномы самца и самки обоих видов. Мт-геномы самца и самки N. pernula не имеют значимых отличий. Для Y. hyperborea показано: (1) отбор, действующий на мужской геном, релаксирован; (2) в обоих организмах (самцах и самках) содержится небольшое число мтДНК противоположного пола в состояние гетероплазмии, при этом оба эти варианта экспрессируются; (3) в мужском мт-геноме найден экспрессирующийся ORFan. Нам удалось показать, что этот участок произошел от митохондриального гена NAD2. Данные результаты иллюстрируют процессы, происходящие на ранних этапах дивергенции мужских и женских мтДНК в базальных двустворчатых моллюсках: дупликации генов и ускоренную эволюцию. В 2025 г. мы предполагаем закончить подготовку к публикации и сдать в печать работу, посвященную этому исследованию. Мы предполагаем также провести секвенирование и сборку мт-генома другого представителя этой группы Portlandia arctica. Всего по результатам работы предполагается сдать в печать не менее 3 статей. 2026 г. 1. Получение последовательностей митохондриальных маркеров для арктических морских беспозвоночных, для которых их не удалось получить ранее. Создание таксонспецифичных праймеров для баркодинга. 1.1. Микротурбеллярии из рода Monocelis (Platyhelminthes, Proceriata). С применением разработанных в 2025 г. праймеров получить последовательности СО1 для всех пяти морфогрупп рода Monocelis. Попробовать применить эти праймеры для баркодинга представителей другого родов беломорских микротурбеллярий. В случае, если эти праймеры не подойдут, провести секвенирование, сборку и аннотацию мт-геномов представителей рода Archilopsis. Если получится, сконструировать универсальные праймеры для баркодинга беломорских микротурбеллярий. 1.2. Cossura pygodactylata (Annelida, Cossuridae). С применением разработанных в 2025 г. праймеров получить последовательности СО1 для 20 образцов коссурид из разных локаций. На материале коллекции Беломорского филиала Зоологического музея МГУ провести ревизию семейства Cossuridae с применением ядерных и митохондриальных маркеров. Подготовка к публикации статьи о филогении коссурид. 1.3. Анализ мт-геномов голопелагических полихет. Создание праймеров для их баркодинга. Получение последовательностей СО1 для представителей изучаемых родов. Уточнение таксономии и изучение филогеографии представителей родов Pelagobia, Vanadis и Typholoscolex. Секвенирование и сборка de novo мт-генома представителя еще одного рода голопелагических полихет – Tomopteris (Annelida, Tomopteridae). Подготовка к печати статьи, посвященной этому исследованию. 2. Публикация статьи по секвенированию генома копепод C. propinquus и исследованию митохондриальной интрогрессии между C. simillimus и C. propinquus. Расследование новых, обнаруженных к этому моменту случаев митохондриальной интрогрессии. 3. Изучение двуродительского наследования митохондрий у представителей базальной ветви двустворчатых моллюсков – протобранхий. В процессе выполнения Проекта 2021 нами было показано, что у изучаемых нами представителей базальной группы двустворчатых моллюсков – протобранхий, Yoldia hyperborea, в обоих организмах (самцах и самках) содержится небольшое число мтДНК противоположного пола в состояние гетероплазмии, при этом оба эти варианта экспрессируются. Это идет вразрез с общепринятым убеждением, что в организме самки присутствуют только женские митохондрии. Мы предполагаем провести анализ экспрессии митохондриальных генов в разных тканях самок Y. hyperborea в целях изучения наличия у них мужских митохондрий и экспрессии их белок-кодирующих генов. Кроме того, мы предполагаем провести секвенирование фрагментов мт-геномов некоторого числа представителей Nuculana pernula. При сравнении мт-геномов самцов и самок мы не нашли значимых отличий. Однако некоторые позиции геномов все-таки различались, и для ответа на вопрос, являются ли эти отличия отражением внутривидового полиморфизма мтДНК или представляют собой еще незначительные, но уже присутствующие различия в мт-геномах самцов и самок, необходимо провести это исследование. Сборка, аннотация и анализ полученных мт-геномов самца и самки Portlandia arctica. Подготовка статьи к публикации. 2027. Завершение всех проектов. Мы ожидаем, что существенная часть усилий нашей команды в последний год выполнения проекта будет направлена на подготовку к публикации статей и эксперименты\анализы, предложенные рецензентами. Всего по результатам проекта предполагается опубликовать не менее 10 статей

Мониторинг состояния арктических экосистем в условиях все возрастающей антропогенной нагрузки – с одной стороны, насущная практическая задача, с другой - фундаментальное научное исследование, потому что для его осуществления необходимо решить ряд важнейших научных вопросов. Одним из основных методов изучения биоразнообразия уже давно стал ДНК-баркодинг - использование коротких последовательностей фрагмента гена, кодирующего первую субъединицу митохондриальной цитохром-с-оксидазы (COI). ДНК-баркодинг лежит в основе таких крупных исследовательских проектов, как глобальные базы данных по видовому разнообразию: The Consortium for the Barcode of Life (CBOL, http://www.barcodeoflife.org/) и the Barcode of Life Data Systems (BOLD, http://www.barcodinglife.org/). В последнее время все более активно развивается метод метабаркодинга. Метабаркодинг ДНК - это метод оценки биоразнообразия окружающей среды и сложных многокомпонентных образцов. Для оптимизации методов баркодинга и метабаркодинга необходимо: (1) развивать и пополнять базу данных последовательностей фрагментов СО1; (2) оптимизировать праймеры,для амплификации фрагмента СО1. Для этого предполагается секвенирование мт-геномов беспозвоночных, для которых не удается использовать стандартные праймеры для баркодинга. (3) определять случаи митохондриальной интрогрессии. Митохондриальная интрогрессия — присутствие митохондриального генома одного вида (донора) в популяции другого вида (реципиента). Подобное явление возникает в результате межвидовой гибридизации и последующих возвратных скрещиваний. При этом присутствие геномной ДНК вида-донора обнаружить не удается, тогда как отсутствие рекомбинации мтДНК приводит к тому, что полученный в результате межвидовой гибридизации митохондриальный геном сохраняется полностью.

Будут отсеквенерованы, собраны и аннотированы полные митохондриальные геномы беломорских микротурбеллярий из родов Monocelis и Archilopsis (сем. Monocelididae). Будет проведена оценка степени полиморфизма и наличия перестроек в мт-геномах представителей разных морфогрупп, которые ранее объединялись в один вид - M. lineata. С использованием информации о последовательностях мтДНК, будут созданы праймеры для баркодинга беломорских микротурбеллярий (по крайней мере для представителей этих двух родов). Будут отсеквенированы, собраны и аннотированы мт-геномы нескольких представителей рода Cossura (Annelida, Cossuridae), для которых не удалось подобрать праймеры на основании определения последовательности мт-генома Cossura pygodactylata и проведена оценка размеров генетических дистанций и различий в структуре мт-геномов представителей одного рода. Будут подобраны праймеры для баркодинга представителей этого семейства. Будет доведена до конца сборка мт-генома полихеты Chitinopoma serrula (Annelida, Serpulidae) и проведено исследование природы межгенных участков, найденных ранее. Будет, по возможности, решена загадка митохондриальных геномов голопелагических полихет Pelagobia longicirrata, Vanadis antarctica (Annelida, Phyllodocidae) и Typholoscolex muelleri (Annelida, Typhloscolecidae), произведены их сборка и аннотация, анализ их структуры и оценка степени их отличий от мт-геномов донных филодоцид. Будут написаны праймеры на фрагменты СО1 и 16S рРНК , по-видимому, отдельно для каждого семейства и далее проведена работа по изучению их филогеографии. Все полученные геномы будут депонированы в базу данных GenBank. Будет получен полный мт-геном Calanus propinquus Brady, 1883 (Copepoda, Calanoida, Calanidae). Будет произведено “расследование” случая интрогрессии митохондриальной ДНК для двух видов рода Calanus: C. propinquus и C. simillimus. Под расследованием мы понимаем: (1) оценку частот различных гаплотипов мтДНК в виде-доноре и виде-реципиенте. Это позволит различить интрогрессию и неполное расхождение видов; (2) сравнительный анализ полных митохондриальных геномов вида-донора и вида-реципиента. По количеству несинонимичных замещений можно оценить относительную приспособленность мтДНК донора и реципиента. Для работ по изучению двуродительского наследования у представителей базальной группы двустворчатых моллюсков – первичножаберных (Bivalvia, Protobranchia) будут: (1) отсеквенированы, собраны и аннотированы мт-геномы самца и самки Portlandia arctica (Bivalvia, Protobranchia); (2) проведено секвенирование фрагментов мт-геномов как минимум пяти самцов и пяти самок Nuculana pernula для оценки значимости различий между мтДНК самца и самки; (3) проведен анализ экспрессии митохондриальных генов в разных тканях самок Yoldia hyperborea в целях изучения наличия у них мужских митохондрий и экспрессии их белок-кодирующих генов. В результате работ по проекту будут подготовлены к печати и опубликованы не менее 10 работ в изданиях, индексируемых в базах данных Web of Science или Scopus.