ИСТИНА

HspB1 – представитель семейства малых белков теплового шока человека, который обладает широким спектром функций, связанных с поддержанием белкового гомеостаза и регуляцией жизнедеятельности в нормальных и стрессовых условиях. HspB1 и его мутантные формы участвуют в возникновении и протекании различных нейродегенеративных (болезни Шарко-Мари-Ту, Альцгеймера и др.) и онкологических заболеваний. Целью данного проекта является изучение структуры и свойств трех химерных белков, состоящих из флуоресцентного белка, прикрепленного к N-концу молекулы HspB1 тремя видами линкерных последовательностей. В результате планируется определить, использование какого вида линкерных последовательностей приводит к наименьшему искажению свойств исследуемого белка в условиях in vitro и in vivo. В ходе выполнения проекта планируется создать молекулярно-генетические конструкты флуоресцентных химер для экспрессии в E.coli и в клетках эукариот, разработать методику выделения химер из клеток бактерий, получить белки в гомогенном состоянии и исследовать их четвертичную структуру, шапероноподобную активность и взаимодействие с белками-партнерами. Предполагается также провести подробное сравнение свойств химерных белков с аналогичными свойствами немодифицированного HspB1. После выбора химер в наименьшей степени отличающихся от белков дикого типа предполагается провести экспрессию указанных белков в клетках эукариот и сравнить химерные белки и немодифицированный HspB1 по их токсичности и способности защищать клетки эукариот от теплового шока. Успешное выполнение проекта позволит разработать новые методические подходы для изучения механизма действия малых белков теплового шока человека и выявить возможное участие этих белков в развитии некоторых патологий.

Получены препаративные количества (10 - 25 мг) 3 типов флуоресцентных химер белка HspB1 в гомогенном состоянии. Для создания химер использовали 12-членные линкеры различной природы. Линкер типа L1 - GSAGSAATGGSA, обладающий высокоподвижной структурой, типа L2 - AEAAAKEAAAKA, образующий альфа-спираль, типа L3 - APAPAPGPAPAP с относительно жесткой структурой. Исследование четвертичной структуры химерных белков показало, что все они образуют меньшие по размеру и менее стабильные олигомеры, чем HspB1 дикого типа. Так HspB1 формировал комплексы с кажущейся молекулярной массой 520-535 кДа (22-23 субъединицы), и их размер не зависел от количества наносимого на гель-фильтрационную колонку белка. Размер олигомеров химер с линкерами L1, L2, L3 существенно зависел от количества нанесенного белка, что указывало на низкую стабильность формируемых комплексов. Их кажущаяся молекулярная масса изменялась в пределах 270 - 470 кДа (5 - 9 субъединиц). При этом не было выявлено различий в свойствах химер с линкерами отличающейся природы. Учитывая, что функциональная активность HspB1 существенно зависит от его олигомерного состояния, можно заключить, что флуоресцентные химеры с использованными линкерами должны обладать иными свойствами по сравнению с белком дикого типа. Исследование шапероноподобной активности с модельным белком-субстратом лизоцимом выявило, что флуоресцентные химеры лучше предотвращают агрегацию частично денатурированного субстрата, чем HspB1 дикого типа. При этом оказалось, что степень изменения свойств химер зависит от используемой линкерной последовательности. Так химера с жестким линкером типа L2 обладала наиболее высокой шапероноподобной активностью, то есть сильнее всего отличалась от HspB1 дикого типа. Химеры с линкерами L1 и L3 также обладали повышенной шапероноподобной активностью, но это проявлялось в меньшей степени. Таким образом, исследованные химерные белки обладали свойствами существенно отличными от свойств белка HspB1 дикого типа. Имеющиеся данные позволяют предположить, что использование при создании флуоресцентных химер линкеров типа L1 или L3, но с большей длиной (более 12 аминокислотных остатков) позволит уменьшить разницу в свойствах между химерным белком и белком дикого типа.