| 1 |
1 января 2014 г.-25 декабря 2014 г. |
Механизмы переключения процессов переноса электрона и темновых метаболических потоков при выделении водорода фотосинтезирующими организмами |
| Результаты этапа: Выполнены эксперименты по изучению фотосинтетической активности в голодающих по сере клетках C. Reinhardtii в иммобилизованной культуре с помощью прибора М-РЕА, предназначен для комплексной оценки функционального состояния фотосистемы 1 и 2 по результатам измерений индуцированных светом кинетических кривых быстрой флуоресценции (кривая OJIP) и одновременной регистрации редокс превращений пигмента Р700 – первичного донора электронов в ФС1. С помощью кинетической модели процессов в ФС2 проанализированы изменения параметров цепи переноса электронов в ходе голодания культуры. Разработана стационарная потоковая модель, включающая центральные метаболические пути (гликолиз, пентозофосфатный путь, цикл Кальвина, цикл Кребса), реакции фотосинтеза и дыхания, хлородыхания и выделения водорода в клетках C.reinhardtii. Модель верифицирована с помощью экспериментальных данных по изменению содержания крахмала, активности Рубиско, активности фотосистемы 2 и Fe-гидрогеназы в процессе голодания в клетках C.reinhardtii. На построенной модели получены стационарные распределения метаболических потоков в разные часы голодания. С целью выяснения механизмов регуляции на молекулярном уровне переключения электронных потоков в акцепторной части ФС1 через Fd с нормального пути на цикл Кальвина фиксации углерода (через FNR) на путь производства водорода (через гидрогеназу) построена многочастичная модель взаимодействия молекул Fd c молекулами FNR и гидрогеназы. Исследовали зависимость скоростей реакций от величины рН, величина которого существенно меняется в процессе голодания культуры. Показано, что при увеличении pH количество электронов, поступающих на фермент гидрогеназу от Fd, увеличивается, что приводит к увеличению скорости выделения водорода |
| 2 |
1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Механизмы переключения процессов переноса электрона и темновых метаболических потоков при выделении водорода фотосинтезирующими организмами |
| Результаты этапа: Для выяснения особенностей организации электрон-транспортной цепи выделяющих водород микроводорослей были выполнены эксперименты по магниевому и серному голоданию. Проведены эксперименты по регистрации OJIP кинетики флуоресценции, кривых редокс переходов Р700 и кинетики замедленной флуоресценции методом MPEA-2 в голодающих по магнию клетках в жидкой культуре C. reinhardtii в аэробных условиях, а также в иммобилизованной культуре в анаэробных условиях. Изучение индукционных кривых показало появление нарушений на акцепторной стороне ФС2: увеличение скорости восстановления QA, появление QВ-невосстанавливающих центров и увеличение восстановленности пула хинонов. Анализ светоиндуцированных изменений редокс состояний Р700 показал, что в аэробных условиях, у голодающих клетках ФС1 находится в более восстановленном состоянии по сравнению с контролем, вероятно, из-за снижения потребности клеток в НАДФН. Показано, что в анаэробных условиях голодающие по магнию клетки осуществляют прямой биофотолиз воды, при котором происходит продолжительное одновременное образование кислорода в ФС 2 и водорода с участием гидрогеназы. Кислород эффективно утилизируется в процессе дыхания, что позволяет поддерживать анаэробные условия и, соответственно, высокую гидрогеназную активность, которая способствует реокислению ЭТЦ. Исследовали влияние разных спектральных полос монохроматического света видимой области на способность к фотообразованию водорода, фотохимическую активность ФС2, а также накопление и расходование крахмала в иммобилизованной культуре C. reinhardtii при инкубации без серы, одного из существенных элементов минерального питания. Показано, что спектральные свойства света играют важную роль в фотообразовании водорода голодающими по сере клетками C. reinhardtii. Впервые нами установлено, что спектральные полосы в синей и красной области видимого света, поглощаемые преимущественно ФС1, способствуют фотообразованию водорода. Данный эффект может быть частично обусловлен стабилизирующим действием света на ФС2 (снижение фотоингибирования) и более эффективным использованием крахмала как источника электронов для синтеза водорода. На основе ранее созданной модели ФС2 (Плюснина и др., 2012, 2013), адекватно описывающей кривые индукции флуоресценции, разработана модель, включающая описание цитохромного комплекса, фотосистемы 1, а также подвижных переносчиков – пластохинона, пластоцианина, ферредоксина. В модель включены также комплексы, участвующие в альтернативных путях переноса электрона на тилакоидной мембране: NADH-дегидрогеназа, пластидная и терминальная оксидаза. Большинство комплексов описано двумя состояниями, окисленным и восстановленным, что позволило, минимально усложняя математическое описание, охватить максимальное число процессов на тилакоиде. Разработана потоковая модель центрального метаболизма клеток водоросли Сhlamydomonas reinhardtii, сопряженного с реакциями фотосинтеза и выделения водорода. Проведен анализ распределения метаболических потоков в клетках, развивающихся в условиях серного голодания. Выполнено молекулярное моделирование конформационной подвижности комплекса восстановленного ферредоксина и окисленной формы гидрогеназы. Для расчетов молекулярной динамики использовали теоретический комплекс гидрогеназы и ферредоксина из зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii, описанный в работе [Chang et al., 2007]. Результаты расчетов свободной энергии образования комплекса восстановленного ферредоксина и окисленной формы гидрогеназы составили +220.1 ± 61 кДж/моль (положительная величина), свидетельствующая о неустойчивости рассматриваемого комплекса. Требуется дальнейшая работа по уточнению структуры комплекса. |
| 3 |
1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Механизмы переключения процессов переноса электрона и темновых метаболических потоков при выделении водорода фотосинтезирующими организмами |
| Результаты этапа: Продуцирование водорода микроводорослями представляет собой процесс, который может быть потенциально использован для получения альтернативного топлива. В ходе выполнения проекта изучены процессы, приводящие к изменению хода метаболизма и переключению фотосинтетического электронного транспорта с пути фиксации углерода и биосинтеза на путь образования молекулярного водорода с участием фермента гидрогеназы. Выполнены эксперименты по регистрации характеристик фотосинтетической активности голодающей по сере и магнию микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii в жидкой среде и культуре, иммобилизованной в тонких кальций-альгинатных пленках, для различных штаммов микроводоросли. В ходе голодания оценены содержание водорода, кислорода и хлоропластных белков. С помощью кинетической модели процессов в ФС2 на основании данных спектральных измерений проанализированы изменения параметров цепи переноса электронов в ходе голодания культуры. Разработана стехиометрическая потоковая модель, включающая центральные метаболические пути (гликолиз, пентозофосфатный путь, цикл Кальвина, цикл Кребса), реакции фотосинтеза и дыхания, хлородыхания и выделения водорода в клетках C.reinhardtii. Модель верифицирована с помощью экспериментальных данных по изменению содержания крахмала, активности Рубиско, активности фотосистемы 2 и Fe-гидрогеназы в процессе голодания в клетках C.reinhardtii. На построенной модели получены стационарные распределения метаболических потоков в разные часы голодания и проведена оптимизация выхода водорода. Объединение и анализ кинетической и потоковой моделей позволило предложить механизм переключения метаболических потоков в процессе минерального голодания. С целью изучения молекулярных механизмов переключения потоков электронов с ферредоксина на ферредоксин-НАДФ-гидрогеназу (путь фиксации углерода и активного фотосинтеза) и гидрогеназу (путь выделения водорода) разработана многочастичная броуновская модель конкурентного взаимодействия ферредоксина с ФНР и гидрогеназой. Исследовано влияние pH, ионной силы и мутаций на скорость взаимодействия белков. Показано, что увеличение pH значительно влияет на свойства электростатического поля гидрогеназы и ее сродство к ферредоксину, что указывает на регуляцию переключения электронных потоков в клетке посредством pH. Идентифицированы аминокислотные остатки, мутации которых потенциально увеличивают скорость взаимодействия ферредоксина и гидрогеназы. |
