ИСТИНА

Одной из основных проблем в борьбе с ВИЧ-инфекцией является быстрое возникновение устойчивости к лекарственным средствам на основе ингибиторов вирусных ферментов. В связи с этим, представляется весьма перспективным новый подход к ингибированию ВИЧ-1, основанный на подавлении взаимодействия вирусных белков с клеточными белками, необходимыми для успешной репликации вируса. Одним из таких белков является Ku70 , который предохраняет от убиквитинилирования и протеосомной деградации вирусный фермент интегразу. Подавление экспрессии Ku70 в клетке приводит к существенному падению уровня репликации ВИЧ-1 и апоптозу клеток. Предполагается, что Ku70 взаимодействует с С-концевым доменом ИН, однако структура этого белкового комплекса не известна. Поскольку взаимодействие Ku70 с ИН важно для эффективной репликации ВИЧ-1, комплекс этого клеточного белка с вирусной ИН может рассматриваться в качестве новой мишени для создания противовирусных препаратов. Соответственно, целью настоящего проекта является детальное изучение молекулярных и структурных особенностей взаимодействия ИН ВИЧ-1 и белка Ku70. Основное внимание будет сосредоточено на установлении доменных структур и ключевых аминокислотных остатков в структуре интегразы, обеспечивающих это взаимодействие. Также планируется оценить влияние мутаций в структуре ИН на ее стабильность в трансфецированных клетках и на ее убиквитинилирование, а также на эффективность интеграции, осуществляемой в однораундной системе. Полученные результаты позволят приступить к созданию модели взаимодействия ИН с белком Ku70 и разработке ингибиторов этого взаимодействия, которые могут стать новым классом блокаторов ВИЧ-инфекции.

One of the main problems in the fight against HIV is the rapid emergence of resistance to drugs based on inhibitors of viral enzymes. In this regard, seems very promising new approach to the inhibition of HIV-1, based on inhibition of the interaction of viral proteins with cellular proteins necessary for successful replication of the virus. One such protein is Ku70 , which prevents ubiquitination and proteasomal degradation of the viral enzyme integrase. The silencing Ku70 in the cell leads to a significant drop in the level of HIV-1 replication and apoptosis. It is assumed that Ku70 interacts with the C-terminal domain of IN, but the structure of this protein complex is not known. Because the interaction with Ku70 IN is important for efficient replication of HIV-1, the complex of this cellular protein IN viral can be considered as new targets for the design of antiviral drugs. Accordingly, the aim of this project is a detailed study of the molecular and structural features of the interaction IN HIV-1 and Ku70 protein. The focus will be on identifying domain structures and key amino acid residues in the structure of integrase, providing this interaction. It is also planned to assess the effect of mutations in the structure in its stability in cells transfected with and ubiquitination, and the efficiency of integration carried out in odnorodnoi system. The obtained results will allow to begin to create models of interaction IN protein Ku70 and the development of inhibitors of this interaction, which can become a new class of blockers of HIV infection.

1. Планируется наладить методику выделения белка Ku70 (и/или его ИН-связывающего фрагмента 1-430 а.к.) в культуре E. сoli, несущего GST-tag на С-конце. В литературе описаны методики выделения гетеродимера Ku70/Ku80 в культуре клеток насекомых (Ono M. et al., 2004) и в культуре E. сoli с использованием бицистронной плазмидной конструкции (Hankahi L.A., 2007). Попытка выделения индивидуального препарата Ku70 будет нами осуществлена впервые. 2. Будут получены рекомбинантные препараты ИН ВИЧ-1 подтипов А и В, точечные мутанты и делеционные мутанты этих ферментов. 3. Будет проведена качественная оценка взаимодействия различных препаратов ИН с Ku70 методом GST pull-down. Впервые будет исследовано взаимодействие Ku70 с С-концевым фрагментом интегразы (220-270 а.к.), а также точечными мутантами R228A, D229A, R231A, D232A, K236A, V250E, K258A, W234E. Взаимодействие ИН подтипа А с Ku70 также будет исследовано впервые. 4. Методом поверхностного плазмонного резонанса впервые будут получены количественные характеристики взаимодействия ИН с Ku70 (константа диссоциации комплекса, скорость образования комплекса, количественные характеристики влияния мутаций на формирование комплекса).

В коллективе накоплен большой опыт работы с ИН ВИЧ, в том числе из подтипа А. Налажена методика получения рекомбинантных препаратов обоих белков, содержащих His6-tag, в клетках E.coli. Важно отметить, что используемая методика выделения ИН в присутствии ионов Zn2+, необходимого для образования активного тетрамера фермента, позволяет получать ИН, активную in vitro без добавления детергентов и в присутствии ионов Mg2+, который является ее природным ко-фактором. Также при выполнении гранта РФФИ № 11-04-01004 налажена методика выделения GST-tag содержащих белков, в частности обратной транскриптазы ВИЧ-1, и методика изучения взаимодействия белков методом pull-down. Ранее получены практически все плазмидные конструкции, необходимые для выполнения проекта: конструкции для прокариотической экспрессии His6-tag меченной ИН и различных делеционных мутантов, как подтипа В, так и А; конструкции для эукариотической экспрессии НА-меченных ИН и делеционных мутантов; конструкции для прокариотической экспрессии целого ряда точечных мутантов ИН (R228A, D229A, R231A, D232A, K236A, V250E, K258A, W234E); конструкции для прокариотической экспрессии GST-Ku70 и для эукариотической экспрессии Ku70-3Flag, как для полноразмерной формы белка, так и для укороченного ИН-связывающего домена (1-430 а.к.).

1. Определена область в структуре ИН и ключевые аминокислотные остатки, обеспечивающие ее взаимодействие с белком Ku70 и его делеционным мутантом Ku70_1-250 в условиях in vitro. 2. Получены данные о взаимодействии ИН (в условиях ее суперэкспрессии) с Ku70 в клетках человека. 3. Определено влияние белка Ku70 на стабильность делеционных мутантов ИН (1-160 и 1-220) в клетках, трансфецированных векторами для эукариотической экспрессии Ku70 и мутантов ИН.