![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Мембранный транспорт ионов белковыми комплексами, участвующими в окислительном фосфорилировании, лежит в основе энергетики живой клетки. Принципы функционирования и регуляции таких ионных помп остаются малоисследованными, что представляет одну из главных проблем современной биоэнергетики. Данный проект направлен на решение этой проблемы для двух ионных помп – Na+-транслоцирующей NADH:хинон-оксидоредуктазы (Na+-NQR) и протонной FОF1-ATPазы (АТР-синтазы). Планируемые исследования будут состоять из пяти частей. В первой части будет идентифицирован полный комплекс генов, необходимых для «созревания» Na+-NQR, что позволит выявить особенности фолдинга данного белка и регуляции его активности в бактериальной клетке. Во второй части мы измерим параметры связывания ионов Na+ с Na+-NQR, а также зависимость прочности комплекса от значения окислительно-восстановительного потенциала. Таким образом, мы планируем проверить гипотезу о том, что восстановление какого-то из кофакторов (“сопрягающего кофактора”) фермента сопровождается захватом Na+ с цитоплазматической стороны мембраны, и идентифицировать “сопрягающий кофактор”. Для выполнения этой части работы будет разработан метод иммобилизации Na+-NQR на твердом сцинтилляторе. В третьей части мы используем метод «остановленной струи» с разрешением 200 мкс для идентификации короткоживущих интермедиатов каталитического цикла изучаемого фермента. Будет также определено влияние ионов Na+ на время жизни этих интермедиатов. На основании этих данных будет сформулирована наиболее полная последовательность окислительно-восстановительных событий в каталитическом цикле фермента и определена стадия сопряжения с трансмембранным транспортом Na+. Четвертая и пятая части будут посвящены мембранным бактериальным ATP-синтазам, транслоцирующим ион Н+, и будут иметь целью определение механизма регуляции их активности величиной протонного потенциала. Планируется получить ответы на вопросы, как фермент определяет уровень протонного потенциала, и какие аминокислотные остатки участвуют в регуляции. Для этого будут созданы компьютерные программы для детального биоинформатического анализа аминокислотных последовательностей мембранных бактериальных ATPаз, позволяющие проводить анализ совокупности последовательностей разных субъединиц этих ферментов, а не только каждой из субъединиц по отдельности. С помощью этих программ будут выявлены перспективные кандидаты на роль регуляторных остатков. Все предсказания будут проверены с помощью широкомасштабного сайт-специфического мутагенеза. Мы также планируем провести кластерный анализ полученных наборов остатков на предмет их корреляции с определенной экологической нишей и оптимальными условиями существования бактерий. В работе будет использован комплекс современных биоинформатических, биохимических, биофизических и молекулярно-генетических методов. Все планируемые результаты будут новыми, не описанными в литературе ни для изучаемых нами, ни для аналогичных ионных помп.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 25 августа 2014 г.-15 декабря 2014 г. | Молекулярные механизмы преобразования энергии при бактериальном окислительном фосфорилировании |
Результаты этапа: В рамках проекта в 2014 году идентифицированы вспомогательные белки, необходимые для сборки и созревания Na+-NQR. Анализ бактериальных геномов показал, что все Na+-NQR-содержащие протеобактерии также содержат в своем геноме ген белка с неизвестными функциями DUF539, расположенный в большинстве геномов рядом с nqr-опероном и/или геном флавин трансферазы apbE. Показано, что гетерологическая экспрессия nqr-оперона из Vibrio harveyi в клетках Escherichia coli приводит к продукции фермента, не способного осуществлять Na+-зависимую хинон редуктазную активность, но сохраняющего способность к осуществлению Na+-независимой (d)NADH-дегидрогеназной активности. Такие же результаты были получены и при гетерологической коэкспрессии nqr-оперона с геном apbE. В то же время гетерологическая коэкспрессия nqr-оперона, гена apbE и гена duf539 приводила к наработке функционально активного Na+-NQR-комплекса, способного к осуществлению обеих отмеченных выше активностей. Более того, инактивация гена duf539 в клетках Klebsiella pneumonia сопровождалась потерей способности Na+-NQR этого микроорганизма к Na+-зависимому окислению (d)NADH. Показана комплементация данной мутации с помощью duf539-содержащей плазмиды. Белок DUF539 содержит 4 консервативных остатка цистеина. Установлено, что замена этих остатков на остатки серина приводит к практически полной потере активности DUF539. Таким образом, мы можем заключить, что DUF539 представляет собой белковый фактор, необходимый для сборки или созревания Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы. Были созданы 2 базы данных аминокислотных последовательностей ATPсинтазы: база из полногеномных бактериальных данных и база из данных GenBank, содержащая также последовательности субъединиц эукариотических ATP синтаз. Был проведен биоинформатический анализ этих данных, на основании которого было построено филогенетическое дерево, а также выявлен набор «ограниченно консервативных» аминокислотных остатков, которые предположительно могут играть важную роль в регуляции фермента. Для одного из этих остатков на E. coli был получен мутант для дальнейшего экспериментального доказательства или опровержения такой роли. В качестве первого шага к этому была налажена методика выделения фермента из клеток E. coli. | ||
2 | 15 января 2015 г.-15 декабря 2015 г. | Молекулярные механизмы преобразования энергии при бактериальном окислительном фосфорилировании |
Результаты этапа: Бактериальные Na+-транслоцирующие NADH:хинон оксидоредуктазы (Na+-NQR) используют уникальный набор простетических групп (два ковалентно связанных остатка FMN, [2Fe-2S] кластер, FAD, рибофлавин и Cys4[Fe] центр) для катализа переноса электронов с NADH на убихинон, сопряженного с трансмембранной транслокацией ионов натрия. В ходе выполнения проекта в 2015 году проведено определение констант скоростей и разностных оптических спектров для шести последовательных кинетических стадий процесса восстановления Na+-NQR из Vibrio harveyi в присутствии NADH. Данная работа проведена с использованием аппарата стоп-флоу с мертвым временем около 0,25 мс и длиной оптического пути 1 см, позволяющего регистрировать оптические спектры с интервалом в 50 мкс. За счет сравнения полученных спектров кинетических стадий с известными модельными спектрами редокс-переходов в кофакторах Na+-NQR произведена идентификация последовательности переноса электронов при восстановлении фермента. В ходе этой работы зарегистрирован ранее неизвестный переход, представляющий собой восстановление Cys4[Fe] центра. Показано, что скорость переноса электрона с [2Fe-2S] кластера на Cys4[Fe] центр значительно ускоряется при повышении концентрации ионов натрия, что указывает на то, что именно эта стадия сопряжена со связыванием иона натрия с ферментом. Для объяснения переноса электронов между субъединицами NqrF и NqrC предложен механизм альтернативного доступа. В соответствии с этим механизмом, Cys4[Fe] центр, находящийся в середине мембране, попеременно доступен для [2Fe-2S] кластера субъединицы NqrF и остатка FMN субъединицы NqrC, находящихся с разных сторон этой мембраны. Na+-NQR обладает уникальным набором простетических групп, включающем в себя два остатка FMN, ковалентно связанных с остатками треонина в субъединицах NqrB и NqrC. Физиологический смысл ковалентного присоединения FMN в этих субъединицах неизвестен. В ходе выполнения проекта в 2015 году проведено исследование связывания свободного FMN с апо-формой NqrC из V. harveyi. Показано, что NqrC обладает очень низкой аффинностью к FMN при отсутствии его ковалентного присоединения. Для исследования структурных аспектов связывания флавина в NqrC получены кристаллы и установлена трехмерная структура с разрешением 1,56 Å для голо-формы этого белка. Показано, что изоаллоксазиновое кольцо остатка FMN погружено в гидрофобную полость белка так, что его пиримидиновая часть зажата между гидрофобными аминокислотными остатками, тогда как бензольная часть изоаллоксазинового кольца выступает из белка в окружающую среду. Такая структура флавин-связывающего участка должна приводить к подвижности бензольного кольца, облегчающей излом изоаллоксазинового кольца FMN при его одно-электронном восстановлении. В тоже время, эти особенности флавин-связывающего участка NqrC могут приводить лишь к относительно слабому нековалентному взаимодействию NqrC с флавином. Этот факт, наряду с периплазматической локализацией FMN-связывающих доменов подавляющего большинства NqrC-подобных белков, может объяснить необходимость ковалентного присоединения этой простетической группы, предотвращающего ее потерю при диссоциации в окружающую бактерии среду. Ген, кодирующий протеородопсин из Dokdonia sp. PRO95 (AEX55013), клонирован и экспрессирован в клетках Escherichia coli. Освещение протеородопсин-продуцирующих клеток E. coli в Na+-содержащих средах вызывало защелачивание среды измерения, которое ускорялось в присутствии протонофора CCCP и ингибировалось проникающим анионом SCN–. Освещение клеток в безнатриевой среде (при замене Na+ на K+) сопровождалось SCN–-стимулируемым и CCCP-чувствительным закислением среды. Освещение протеородопсин-содержащих клеток E. coli приводило к CCCP-устойчивому трансмембранному транспорту ионов натрия из этих клеток. Таким образом, установлено, что протеородопсин из морской флавобактерии Dokdonia sp. PRO95 является первичной светозависимой натриевой помпой. Высокий уровень гетерологической продукции этого белка в клетках E. coli, а также стабильность и чистота выделяемых препаратов делают данный протеородопсин удобной моделью для изучения механизма активной трансмембранной транслокации ионов натрия. | ||
3 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Молекулярные механизмы преобразования энергии при бактериальном окислительном фосфорилировании |
Результаты этапа: Na+-транслоцирующие родопсины (NaR) являются свето-зависимыми ионными помпами, используемыми разнообразными морскими бактериями для откачки ионов натрия из цитоплазмы. В ходе выполнения проекта в 2016 году мы исследовали фотоцикл NaR из морской флавобактерии Dokdonia sp. PRO95 и идентифицировали электрогенные и Na+-зависимые стадии этого цикла. Было показано, что фотоцикл NaR состоит из по крайней мере четырех стадий: NaR519 + hv –> K585 –> (L450<–>M495) –> O585 –> NaR519. Третья стадия этого фотоцикла (образование интермедиата О) оказалась единственной Na+-зависимой стадией, зависящей от концентрации ионов натрия с цитоплазматической стороны мембраны, что указывает на то, что именно эта стадия сопряжена со связыванием ионов натрия с NaR. Для стадий 2, 3 и 4 были определены кинетические константы скоростей равные 40 000 с–1, 4 700 M–1 с–1 и 150 с–1, соответственно. Вклад этих стадий в генерацию трансмембранного электрического потенциала составлял 15, 15 и 70% от суммарного электрического потенциала (~200 мВ), образованного при единичном обороте NaR в протеолипосомах. Также мы показали, что замена остатка Gln123 в цитоплазматическом участке ион-проводящего канала NaR из Dokdonia sp. PRO95 на аспартат или глутамат приводит к появлению H+-транслоцирующей активности у этого белка. Установлено, что Q123E вариант NaR обладает способностью к протонному транспорту в клетках Escherichia coli даже в присутствии 100 мМ Na+. Скорость протекания различных стадий фотоцикла этого мутантного белка лишь в очень незначительной степени зависела от концентрации ионов натрия. Также продемонстрировано, что при транспорте протона основные электрогенные стадии представляют собой распад интермедиатов K и O. На основании полученных результатов предложен механизм свето-зависимой трансмембранной транслокации ионов натрия этим ретиналь-содержащим белком. В ходе выполнения проекта также исследована возможность присутствия каротиноидной антенны в NaR из Dokdonia sp. PRO95. Проведена экстракция каротиноидов Dokdonia sp. PRO95 и показано, что зеаксантин является основным каротиноидом этой бактерии. Инкубация препарата рекомбинантного NaR, выделенного из клеток E. coli, с каротиноидами Dokdonia sp. PRO95 не сопровождалась изменениями в оптических спектрах поглощения и кругового дихроизма, свидетельствующими о связывании этих каротиноидов с NaR. Такие же результаты были получены и при использовании салиниксантина в качестве каротиноида. Эти результаты, наряду с данными анализа геномов Dokdonia sp. PRO95 и других флавобактерий, позволяют заключить, что NaR из Dokdonia sp. PRO95, а также, по-видимому, и другие Na+-транслоцирующие родопсины из флавобактерий не содержат каротиноидной антенны. Кроме того, в рамках проекта в 2016 году был завершен биоинформатический анализ аминокислотных последовательностей каталитических субъединиц бактериальных АТР-синтаз. Было выявлено 5 подсемейств ферментов, причем 4 из этих подсемейств укладывались в определенные филогенетические клады, тогда как пятое было представлено серди бактерий разных таксономических групп. Именно для последнего подсемейства характерно сильное MgADP-ингибирование АТРазной активности фермента. Вероятно, это свойство дает определенное эволюционное преимущество, из-за чего оперон фермента данного подсемейства с повышенной вероятностью распространяется между бактериями разных филогенетических групп с помощью горизонтального переноса генов. Экспериментальное изучение влияния мутаций в позициях, тип аминокислоты в которых различался между семействами, выявило еще один остаток, влияющий на MgADP-ингибирование АТР-синтазы. Было обнаружено, что в присутствии фосфата мутантный фермент с заменой бетаPhe189Leu демонстрировал значительное ослабление MgADP-ингибирования ATPазной активности, которое, впрочем, исчезало в условиях разобщения мембраны – эффект, описанный ранее для мутанта бетаLeu249Gln. Таким образом, были идентифицированы индивидуальные аминокислотные остатки, отвечающие за модуляцию силы MgADP-ингибирования АТР-синтаз. | ||
4 | 25 апреля 2017 г.-29 декабря 2017 г. | Молекулярные механизмы преобразования энергии при бактериальном окислительном фосфорилировании |
Результаты этапа: H+-, Cl– и Na+-помпирующие родопсины используют ковалентно связанный ретиналь в качестве хромофора. Для улучшения светопоглощающих свойств некоторые H+-помпирующие родопсины (ксантородопсины) также дополнительно содержат в своем составе каротиноидную антенну. При выполнении проекта в 2017 году проведено сравнение первичных и третичных структур различных родопсинов, которое показало, что остаток треонина (Thr216) в Na+-помпирующем родопсине из Dokdonia sp. PRO95 (NaR) препятствует связыванию каротиноидов в этом белке. Была проведена замена этого остатка NaR на глицин, который присутствует в соответствующей позиции в ксантородопсинах, а полученная мутантная форма NaR была продуцирована в штамме Escherichia coli, способном к синтезу кетокаротиноидов. В отличие от NaR дикого типа, выделенная мутантная форма белка содержала прочно связанные каротиноиды кантаксантин и эхиненон. Эти каротиноиды детектировались в адсорбционном и КД-спектрах белка, а также в спектре возбуждения флуоресценции ретиналя. Полученные данные показывают возможность функционирования связанных каротиноидов в Thr216Gly NaR в качестве светособирающей антенны. Также показано, что проведенная аминокислотная замена, а также связывание каротиноидов не приводят к изменениям в фотоцикле NaR. Наши наблюдения указывают на то, что каротиноидная антенна была потеряна при эволюции NaR, но она может быть восстановлена единичной аминокислотной заменой. По направлению исследований бактериальной АТФ синтазы была разработана и опробована методика выявления роли АДФ-ингибирования in vivo. Два штамма E. coli - дикий тип и штамм с усиленным АДФ-ингибированием выращивались в совместной культуре. Доля клеток каждого из штаммов в ростовой среде оценивалась различными методами (ПЦР в реальном времени и высеванием на чашки с селективными антибиотиками). Было установлено, что при выращивании на среде LB в условиях хорошей аэрации штамм дикого типа вытесняет из совместной культуры мутантный штамм с усиленным АДФ-ингибированием. Сходный результат был получен и при выращивании в среде LB в условиях пониженной аэрации. Кроме того, завершены эксперименты по характеризации трех полученных в 2016 г мутантных вариантов АТФ синтазы E. coli - бета-Phe189Leu, бета-Phe139Tyr и бета-Val319Thr. Для мутанта бета-Phe189Leu установлено, что введенная замена ослабляет АДФ-ингибирование в присутствии фосфата как в условиях сопряженного с транспортом протонов гидролиза АТФ, так и несопряженной АТФазной активности в присутствие разобщителя. С помощью биоинформатического анализа выбраны семь аминокислотных остатков CBS-пирофосфатазы из Desulfitobacterium hafniense как наиболее вероятные кандидаты на участие в регуляции фермента, получены 14 генетических конструкций, содержащих мутантные формы с заменами указанных остатков, выделены и очищены четыре мутантные формы пирофосфатазы. Проведен детальный кинетический анализ кинетики гидролиза пирофосфата мутантными формами фермента в широком диапазоне концентраций металла-кофактора (только для R334A) и влияния на нее АМР, ADP, АТР и диаденозинтетрафосфата. На основании результатов анализа сделан вывод об участии трех остатков в передаче регуляторного сигнала в ферменте. Две замены привели к появлению отрицательной кинетической кооперативности, что показывает важность этих остатков для взаимодействия активных центров через зону контакта каталитических доменов. Одна из замен привела к обращению эффекта АТР, который из активатора стал ингибитором фермента. Вариант E267A по кинетическим параметрам, а также по эффектам фосфатных производных аденозина и их параметрам связывания обнаружил значительное сходство с ферментом дикого типа. Эти данные свидетельствуют о неучастии Glu267 в регуляции и его малой значимости для катализа. | ||
5 | 4 апреля 2018 г.-29 декабря 2018 г. | Молекулярные механизмы преобразования энергии при бактериальном окислительном фосфорилировании |
Результаты этапа: Бактериальные Na+-транслоцирующие родопсины запасают энергию Солнечного света в виде электрохимического трансмембранного ионного потенциала. Обычно эти белки высоко-специфичны по отношению к Na+, но некоторые из них в безнатриевых средах также способны к трансмембранной транслокации протонов. Для определения структурных основ ионной специфичности мы провели сравнение первичных и третичных структур различных Na+-родопсинов и выявили позицию, где во всех специфичных Na+-родопсинах присутствует цистеин, тогда как в Na+,Н+-родопсинах – серин. Показано, что полученный в ходе выполнения проекта Cys253Ser мутантный вариант специфичного Na+-родопсина из Dokdonia sp. PRO95 (NaR) в отличие от белка дикого типа действительно способен к светозависимому трансмембранному траспорту и Na+, и H+. Двойная специфичность этого мутантного варианта NaR была также подтверждена при анализе его фотоцикла, выявившего ускорение стадии захвата катиона с цитоплазматической стороны мембраны в не содержащей ионов натрия среде измерения. Также в ходе выполнения проекта с помощью импульсной EPR-спектроскопии был обнаружен парамагнитный Cys4[Fe] центр в Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазе (NQR) по влиянию этого центра на спин-спиновую и спин-решеточную релаксацию флавиновых радикалов этого фермента. Анализ температурных зависимостей скоростей релаксации флавиновых радикалов указывает на то, что степень восстановленности Cys4[Fe] центра соответствует Fe3+ в окисленном и Fe2+ в восстановленном препаратах NQR. Для обеих форм NQR показано, что Cys4[Fe] центр находится в высокоспиновом состоянии. Изменение релаксационных свойств Cys4[Fe] при восстановлении NQR указывает на возможность окисления/восстановления этого центра в ходе каталитического оборота фермента, то есть на участие этого центра в пути переноса электронов в NQR. В 2018 г. были закончены исследования влияния одиночных замен в субъединице бета: L249Q, F139Y, V319T и F189L на активность и ADP-ингибирование ATP синтазы E. coli. В случае бетаL249Q, на очищенных препаратах дикого типа и мутантной форм F1-субкомплекса, а также FоF1-ATP-синтаз, встроенных в липосомы, было показано, что в мутантном ферменте усиливается ADP-ингибирование. Кроме того, у мутантного фермента неорганический фосфат не усиливал, а ослаблял ADP-ингибирование. Таким образом, замена бетаL249Q “переключила” режим ADP-ингибирования с варианта, характерного для E. coli, на вариант, описанный у митохондриального, хлоропластного и большинства бактериальных ферментов, не оказав заметного влияния на скорость синтеза ATP инвертированными мембранными частицами E. coli, и на катализируемый ферментом АТФ-зависимый протонный транспорт. Этот результат позволяет предположить, что ADP-ингибирование является адаптивным признаком, сохраняемым в процессе эволюции. В пользу этого вывода говорят и результаты проведенных экспериментов по совместному выращиванию штамма дикого типа и мутантного штамма B. subtilis. Мы показали, что во всех исследованных условиях роста штамм с сильным ADP-ингибированием вытеснял из совместной культуры штамм с ослабленным ADP-ингибированием. Также в 2018 г была создана и опубликована в сети Интернет база данных оперонов прокариотических ATP синтаз F-типа из разных организмов. Доступный по адресу http://atp-s.genebee.msu.ru/ сайт позволяет пользователю по запросу получить информацию об ADP синтазах из 711 прокариотических геномов, представляющих репрезентативную выборку всех бактерий и архей. Получены 10 мутантных форм CBS-пирофосфатазы из Desulfitobacterium hafniense с единичными заменами семи аминокислотных остатков (Ser, Glu, Lys, 3 Arg и Asn), предположительно участвующие в регуляции фермента адениновыми нуклеотидами. Проведен детальный кинетический анализ кинетики гидролиза пирофосфата 14 мутантными формами фермента и влияния на нее АМР, ADP, АТР и диаденозинтетрафосфата. Полученные данные подтвердили участие пяти остатков (Glu, 3 Arg и Asn) в передаче регуляторного сигнала между регуляторными и активными центрами в димерном ферменте. Несколько замен привели к обращению кинетической кооперативности из положительной в отрицательную, две замены превратили АТР из активатора в ингибитор. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".