Природные и синтетические регуляторы деградации аминокислот для фармакологической коррекции патологий человека и животныхНИР

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 24 июня 2014 г.-31 декабря 2014 г. Природные и синтетические регуляторы деградации аминокислот для фармакологической коррекции патологий человека и животных
Результаты этапа: Оптимизация методов тестирования комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот в гомогенатах тканей животных. Синтез и очистка ингибиторов 2-оксоглутаратдегидрогеназы и 2-оксоадипатдегидрогеназы. Определение относительной специфичности действия синтезированных ингибиторов на соответствующие комплексы дегидрогеназ 2-оксокислот. Дифференциация вклада 2-оксоглутаратдегидрогеназы и 2-оксоадипатдегидрогеназы в окисление 2-оксоглутарата и 2-оксоадипата тканями животных. Определение влияние введения животным тиамина на активность комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот в различных тканях животных, на нейротоксическое действие глутамата при травме спинного мозга и на метаболизм аминокислот мозга при гипоксии. Определение влияния введения животным ингибитора 2-оксоглутаратдегидрогеназы на физиологические параметры.
2 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Природные и синтетические регуляторы деградации аминокислот для фармакологической коррекции патологий человека и животных
Результаты этапа: В отчетном году было продолжено исследование и применение ингибиторов дегидрогеназ 2- оксокислот для фармакологической регуляции метаболизма. Эффективность исследований была повышена путем оптимизации (Trofimova et al., 2015) и расширения методов регистрации наблюдаемых изменений. Влияние ингибиторов на физиологические функции и пул свободных аминокислот изучали в системе культивируемых животных клеток, как первичных, так и трансформированных (Bunik et al., 2015; Aleshin et al., 2015; Diaz-Muñoz MD et al., 2015), и на уровне целостного организма. Эффекты in vivo активатора дегидрогеназ 2-оксокислот тиамина исследовали in vitro и in silico (Mkrtchyan et al., 2015). В качестве нейропротектора при тяжелой спинальной травме крыс тиамин был исследован in vivo. Положительное действие тиамина на реабилитацию после травмы может быть обусловлено как коферментными и аллостерическими эффектами тиамина на метаболические ферменты мозга (Aleshin et al., 2015; Mkrtchyan et al., 2015), так и необходимостью тиамина для активации В-лимфоцитов, при которой происходит сопряженная пост-транскрипционная регуляция экспрессии митохондриального транспортера тиаминдифосфата и 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (Diaz-Muñoz MD et al., 2015). В культивируемых клетках показано, что ингибирование дегидрогеназ пирувата или 2-оксоглутарата нарушает гомеостаз, вызывая в первую очередь адаптационные изменения включающего дегидрогеназы участка метаболической сети. Фиксируемые при этом изменения метаболома выражены не только в пуле 2-оксокислот и сопряженных с ними аминокислот, но и в существенно более отдаленных участках метаболической сети. Наблюдаемые под действием ингибиторов дегидрогеназ 2-оксокислот изменения пула свободных аминокислот зависят как от специфического сайта ингибирования (пируват- или 2-оксоглутаратдегидрогеназа), так и от метаболических особенностей клеток. Специфический для данного типа клеток метаболизм приводит к различной эффективности ингибиторов в снижении клеточной жизнеспособности. Существенные различия в изменениях метаболома и жизнеспособности мы наблюдали даже при использовании гистологически сходного типа клеток, таких как глиобластомные клетки опухолей мозга человека. Значительные изменения аминокислотного профиля под действием ингибиторов пируватдегидрогеназы в клеточных линиях глиобластомы, не экспрессирующих второй компонент пируватдегидрогеназного комплекса, подтверждают высказанную ранее идею о значении в метаболизме раковых клеток побочных карболигазных реакций, свойственных первому (пируватдегидрогеназному) компоненту. Мембрано-проницаемую форму ингибитора пируватдегидрогеназы ацетилфосфоната, перспективность которой была показана в клеточных исследованиях, использовали для интраназального введения животным с целью регуляции синтеза основных аминокислотных нейротрансмиттеров в мозге. Определенные в экстрактах мозга этих животных изменения аминокислот сопровождались физиологическими эффектами, такими как снижение тревожности, регуляция сердечной деятельности и повышение устойчивости к острой гипоксии. Вызываемые ингибитором пируватдегидрогеназы снижение уровня глутамата в мозге и увеличение устойчивости к гипоксии могут иметь нейропротекторное действие при нейродегенеративных состояниях, в которых нарушено снабжение кислородом и нейроны подвержены глутаматной нейротоксичности. Таким образом, полученные в проекте результаты могут найти применение для оптимизации терапий нейродегенеративных поражений мозга, в частности, при травмах мозга. Разрабатываемые подходы могут быть использованы и для персонализированной диагностики метаболических особенностей опухолей с целью назначения наиболее эффективной противоопухолевой терапии.
3 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Природные и синтетические регуляторы деградации аминокислот для фармакологической коррекции патологий человека и животных
Результаты этапа: Осуществлены синтез и очистка фосфоновых и фосфиновых аналогов -специфических ингибиторов дегидрогеназ пирувата, разветвленных 2-оксокислот, 2-оксоглутарата и 2-оксоадипата - в количествах, позволивших провести запланированные эксперименты на клеточных линиях и животных. Исследованы механизмы действия фосфоновых аналогов 2-оксоглутарата и 2-оксоадипата на активности соответствующих дегидрогеназ в гомогенатах тканей и в частично очищенных препаратах ферментов. Показана разница метаболических эффектов данных фосфоновых аналогов при действии ин витро, ин ситу (на клетки) и ин виво (на крысах). Изучение действия сукцинилфосфоната на 2-оксоглутаратдегидрогеназу в разных типах раковых клеток показало значимость данного участка метаболизма для перерожденных клеток. При этом показано, что кинетика снижения жизнеспособности при ингибировании 2-оксоглутаратдегидрогеназы согласуется с результатами транскриптомного анализа и независимыми тестами, указывающими на клеточную специфичность метаболических последствий ингибирования сукцинилфосфонатом. Таким образом, применение сукцинилфосфоната на первичных культурах трансформированных клеток от пациентов может быть использовано в аналитических целях для выработки оптимальных терапий с учетом индивидуальных особенностей пациента. Исследование защитного эффекта фосфоновых аналогов при спинальной травме показало некоторые положительные эффекты по биохимическим параметрам, однако физиологический тест ВВВ не обладал достаточной чувствительностью для подтверждения этих эффектов на уровне тестируемой двигательной активности. Возможно, применяемый способ интраназального введения аналогов обеспечивал большее действие на исследованные ткани головного мозга, чем на область травмы спинного мозга. В случае регуляции дегидрогеназ 2-оксокислот их физиологическим активатором - тиамином - использовали внутрибрюшинное введение, поскольку известно, что тиамин проникает через кровь в мозг. Определенные при введении тиамина позитивные изменения в биохимических параметрах животных со спинальной травмой подтвердились и на уровне теста ВВВ. Исследованы молекулярные механизмы долгосрочного действия введенного крысам тиамина (400 мг/кг i.p. однократно) на метаболизм мозга. С использованием найденных условий дискриминации активностей тиаминдифосфат (ТДФ)-зависимых дегидрогеназ 2-оксоглутарата и 2-оксоадипата охарактеризована специфическая регуляция тиамином полиферментных комплексов 2-оксоглутаратдегидрогеназы (ОГДК) и 2-оксоадипатдегидрогеназы (ОАДК) в разных отдела мозга. Показано, что регуляция этих активностей тиамином сопряжена с перестройкой метаболизма, включающей (1) компенсаторные изменения ассоциированных с циклом трикарбоновых кислот ферментов центрального метаболизма, (2) уменьшение содержания ряда аминокислот в плазме крови и (3) специфические для разных отделов мозга изменения метаболизма аминокислот. В дополнение к анализу ферментативных активностей и средних уровней аминокислот в крови и тканях, метаболические перестройки после введения тиамина охарактеризованы с помощью корреляционного анализа. Показана высокая чувствительность корреляций между уровнями аминокислот в качестве диагностических маркеров тканеспецифического метаболизма и его регуляции тиамином. Вызываемые введением тиамина процессы зависят от исходных уровней экспрессии ТДФ-зависимых дегидрогеназ 2-оксокислот в тканях. В коре больших полушарий исходные уровни относительно велики и не повышаются в результате введения тиамина, однако изменения метаболизма выражены в большей степени, чем в мозжечке, где тиамин активирует исходно низкие уровни ОГДК и ОАДК. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что тиамин снижает катаболизм аминокислот в тканях путем комплексной и долговременной регуляции потока метаболитов через цикл трикарбоновых кислот, связанной с изменениями активностей дегидрогеназ 2-оксоглутарата и 2-оксоадипата. В связи с тем, что проведенная работа показала существенную роль тиаминовой регуляции нового фермента - дегидрогеназы 2-оксоадипата - в метаболизме аминокислот, проведены работы по частичной очистке данной ферментной системы из разны тканей. Для этого была исследована экспрессия 2-оксоадипатдегидрогеназы по базам данных. Измерения активности фермента по разработанному нами протоколу согласуются с транскриптомными данными из независимых источников. Найденные в данной работе условия для дифференциального определения активностей дегидрогеназ 2-оксоадипата и 2-оксоглутарата в гомогенатах мозга позволяют видеть различия в in vivo регуляции данных ферментов тиамином и закладывают основу для дальнейшей характеристики биологической роли новой ТДФ-зависимой дегидрогеназы 2-оксоадипата. В целом, проведенное нами исследование показало, что однократное введение животным регуляторов активности ТДФ-зависимых дегидрогеназ 2-оксокислот вызывает долговременные последствия для активностей ферментов мозга, включая не только сами дегидрогеназы 2-оксокислот, но и функционально ассоциированные с ними ферменты. Результатом такой комплексной регуляции под действием тиамина является перестройка метаболизма, ограничивающая деградацию аминокислот. Такие ограничения видны в снижении уровней аминокислот в плазме крови и изменениях метаболического взаимодействия между аминокислотами. Эти данные могут быть использованы для коррекции ряда патологий, связанных с повышенной деградацией аминокислот, ведущей к снижению синтеза белков в организме. Значительные изменения метаболизма аминокислот мозга происходят и при действии фосфоновых аналогов - ингибиторов дегидрогеназ 2-оксокислот. На основе анализа полученных результатов можно сделать вывод о том, что применение аналогов может послужить развитию системной биологии ввиду возможностей их использования для моделирования и изучения последствий метаболических пертурбаций в живых системах.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".