ИСТИНА

Проект направлен на выяснение действия протеиназ гемостаза - тромбина и активированного протеина С (АРС), на функции тучных клеток (ТК) при остром воспалении, а также их влияния на выживаемость нейронов и астроцитов мозга в модели фокальной ишемии мозга с целью выявления новых механизмов и новых мишеней действия тромбина и АРС при этой патологии. Ишемический инсульт – тяжелая форма сосудистых поражений мозга. Активация локализованных вдоль сосудов ТК при повреждении мозга приводит к высвобождению медиаторов воспаления, протеаз, нарушению целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), увеличению очага ишемического и геморрагического отека мозга. Ранее мы показали, что APC ингибирует секрецию гистамина ТК при остром экспериментальном воспалении у крыс (Русанова и др., 2009) и защищает культивируемые нейроны мозга крыс от гибели в модели инсульта (эксайтотоксичность, вызванная гиперактивацией глутаматных рецепторов) (Gorbacheva et al., 2009). Мы предположили, что если АРС в начальной фазе острого воспаления будет ингибировать секрецию тучными клетками медиаторов воспаления и их экспрессию, это приведет к стабилизации ГЭБ и защите нейронов мозга от гибели. Учитывая, что появление тромбина в очаге повреждения мозга может привести к запуску реактивного астроглиозиса, одной из основных причин гибели нейронов, мы предполагаем, что АРС способен ингибировать повреждающее действие тромбина на клетки мозга. В настоящей работе мы планируем изучить влияние АРС на: 1. освобождение тучными клетками медиаторов воспаления (цитокинов – интерликина-6, фактора некроза опухоли альфа и др.) и их экспрессию в модели острого воспаления; 2. активацию транскрипционного фактора NF-kB и транслокацию его субъединицы NF-kB p65 в ядро этих клеток; 3. выживаемость ТК при остром воспалении; 4. выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов крыс при их кокультивировании с ТК (в норме и при воспалении); 5. развитие реактивного астроглиозиса при токсичности, вызванной тромбином. Мы планируем также, исследовать влияние эксайтотоксичности и фокальной ишемии головного мозга на уровень рецепторов, активируемых протеиназами (PAR) в клетках мозга крыс. Предлагаемый проект позволит выявить новые клеточные и молекулярные механизмы функционирования и взаимодействия ТК, астроцитов и нейронов в норме и при патологических воздействиях и разработать новые подходы для направленной терапии острых ишемических и геморрагических повреждений мозга.

1.Изучены механизмы противовоспалительного действия активированного протеина С (АРС) на перитонеальные тучные клетки (ТК) крыс, активированные в модели острого экспериментального воспаления, вызванного внутрибрюшинным введением тиогликолата. При изучении динамики появления маркеров воспаления, интерлейкина 6 (IL-6) и интерлейкина 1? (IL-1?), с помощью ELISA, обнаружено, что содержание этих цитокинов в ТК возрастает, достигая максимума через 4 часа после индукции воспаления. Установлено, что АРС, введенный внутрибрюшинно после индукции воспаления, вызывает существенное (на 48%) снижение уровня цитокинов (IL 6 и IL 1?) в ТК через 4 часа после воздействия и снижает их высвобождение в перитониальную полость (по сравнению с контрольной группой крыс с острым воспалением). Показано, с помощью ОТ-ПЦР, что АРС через 4 часа также существенно снижает уровень экспрессии генов IL-6 и IL 1? в ТК (по сравнению с клетками контрольной группы). 2.Исследована динамика выживаемости тучных клеток в модели острого воспаления у крыс и влияние АРС на гибель ТК при воспалении. При анализе динамики выживаемости ТК в течение 4 часов после индукции воспаления с помощью МТТ метода выявлено существенное (в 5 раз), снижение количества живых ТК уже через 1,5 часа развития острого воспаления. Установлено, что введение АРС в концентрации 5 нМ (но не 1 нМ) эффективно снижало гибель клеток в течение всего периода исследования. Однако, для статистической обработки результатов необходимо провести дополнительные серии экспериментов. Одной из причин протекторного действия APC на функции ТК при остром воспалении может быть стабилизация цитоскелета ТК. Наши данные открывают дальнейшие направления в исследовании и объяснении протекторных функций этой протеиназы при остром воспалении. 3. Изучено влияние АРС на активированные тромбином (который появляется в тканях мозга при нейровоспалении, геморрагическом инсульте и др.) иммунокомпетентные клетки мозга –астроциты. При изучении с помощью комплекса современных методов (иммуноцитохимического, иммуноблоттинга и конфокальной микроскопии) влияния возрастающих концентраций тромбина (от 1 нМ до 1 мкМ) на культивируемые астроциты крысы установлено, что тромбин в концентрациях выше 10 нМ вызывает активацию культивируемых астроцитов, появление маркера астроглиозиса - белка S100B в культуре, и развитие астроглиозиса. Обнаружено, что через 24 часа после воздействия тромбина наблюдается значимая активация процесса пролиферации и возрастание экспрессии белка S100b в культивируемых астроцитах крысы. 4. Показано, что АРС в концентрациях 1 нМ и 10 нМ снижает пролиферацию астроцитов, вызванную тромбином на 50% и 63%, соответственно. Таким образом, нами продемонстрирован новый аспект протекторного действия АРС как фактора, супрессирующего активацию астроцитов, вызванную провоспалительным действием тромбина, что указывает на возможность использования в дальнейшем АРС как регулятора астроглиозиса при патологических состояниях мозга.