| Результаты этапа: При исследовании формирования планарной полярности эмбрионального ресничного эпителия Xenopus laevis были клонированы гены, кодирующие маркёры планарной полярности цилий (centrin и mig-12), и слиты с кодирующими последовательностями флуоресцентных белков RFP и GFP, соответственно. Синтезированная с полученных конструктов РНК, кодирующая centrin-RFP и mig-12-GFP, была инъецирована в зиготы Xenopus laevis на стадии 2-х бластомеров, которые по достижении стадий развития, когда формируются цилии в клетках покровного эпителия, изучали с использованием лазерной конфокальной микроскопии. Полученные результаты обрабатываются.
Проведена цейтрафферная микрокиносъемка зародышей Xenopus на стадиях поздней бластулы – нейрулы с использованием программы, позволяющей определять 2-мерные координаты индивидуальных клеток. Предварительные измерения выявили неизвестные ранее периоды «замирания» клеточных движений, чередующиеся с периодами относительно быстрых направленных движений с резко меняющимися углами. Ведется статистическая обработка результатов.
Проведены эксперименты по разноуровневым продольным сращиваниям зародышей шпорцевой и травяной лягушек, различающихся по темпам сомитогенеза, позволяющие выяснить, насколько жестко размеры и форма сомитов определяются «часами сегментации», или же существуют корректирующие механизмы на уровне контактных клеточных взаимодействий.
Проведено исследование роли щелевых клеточных контактов и механочувствительных сигнальных механизмов в осуществлении пульсационного роста столонов гидроидного полипа Gonothyraea loveni. Показано, что специфические ингибиторы щелевых контактов октанол и карбеноксолон, ингибитор механочувствительных ионных каналов ион гадолиния (III) концентрационно-зависимо вызывают остановку движений клеток эпидермы, но не прекращают периодические изменения формы гастродермальной трубки. Гистологическое исследование верхушек роста подвергнутых действию исследуемых веществ и статистическая обработка углов наклона клеток эпидермы показало, что при ингибировании щелевых контактов клетки функциональное состояние клеток эпидермы соответствует стадии сокращения нормального пульсационного роста, тогда как при блокировании активности механочувствительных ионных каналов морфологически клетки соответствуют стадии вытяжения.
Прослежена пространственно-временная динамика механозависимых ионных каналов в эмбриональном развитии Xenopus. Показано присутствие на ранних стадиях следующих каналов: TRPV1, TRPV4, TRPM4, TRPM7, TRPC1, TRPC4, TRPC6, TRPA1, PKD1, PKD2, Piezo1, Piezo2, ENaC β, γ, δ, SAKCa, CFTR. Как правило, количество соответствуюих мРНК резко увеличивается к поздним стадиям — нейруле, стадии вылупления и у личинки. Селективные калиевые каналы — 2P-калиевые каналы, к которым относятся TREK1, TREK2 и TRAAK, необходимые для раннего развития млекопитающих, у Xenopus tropicalis на ранних стадиях развития нами они обнаружены не были. Для каналов TRPC1, TRPV4 и TRPM7 прослеживается апикально-вегетативный градиент, в остальных же случаях распределение было равномерным. Установлено, что транскрипты Piezo1на ранних стадиях присутствует в большом количестве и расположен равномерно. На стадии гаструлы наблюдается увеличение экспрессии в области дорсальной мезодермы. Возможно, он участвует в конвергентной интеркаляции дорсальной мезодермы. На поздних стадиях Piezo1 локализуется в слуховом пузырьке, хрусталике глаза, желудочках мозга, в нервной трубке и в покровных тканях с наибольшей экспрессией в передней части тела, что позволяет говорить об участии этого канала в развитии указанных структур. На ранних стадиях присутствует канал SAKCa, имеющий несколько сплайсинговых форм, лишь одна из которых является механочувствительной. Эта сплайсинговая форма с доменом STREX показывает отрицательную количественную динамику во времени. Совместно с коллегами из университета Гёттингена (Германия) была исследована экспрессия мРНК каналов Pkd1, Pkd2 и Pkd1l2 во время гаструляции у зародышей курицы. PKD1l2 не экспрессируется на стадии гаструляции, Pkd1 экспрессируется равномерно по всему зародышу. Ген PKD2 на стадии ранней гаструлы экспрессируется равномерно по всему эпибласту зародыша, однако, с заметным увеличением в области гензеновского узелка, которая является организатором. На более поздних стадиях выявляется неравномерный паттерн в виде двух симметричных пятен позади гензеновского узелка.
Были клонированы гены механозависимых каналов: TRPC1, TRPC6, TRPV4. Начаты эксперименты по выявлению функций этих генов в раннем развитии Xenopus. Установлено, что оверэкспрессия TRPV4 приводит к нарушению целостности эпителиального пласта и потере эпителиального фенотипа субэпителиальных клеток на стадии поздней бластулы.
Созданы генетические конструкты позволяющие интегрировать биосенсоры Case12 и ArcLight-A242 в геном Xenopus. Отработана методика трансгенеза и проведено несколько процедур трансгенеза Xenopus. По достижении необходимого возраста головастиками Xenopus, будут проведен анализ успешности встраивания конструкта в геном.
|
