В связи с техническими работами в центре обработки данных, возможность загрузки и скачивания файлов временно недоступна.
 

Получение мутантных форм пенициллинацилазы и Д-аминопептидазы с улучшенными каталитическими свойствами при помощи методов компьютерного дизайна и генетической инженерииНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2014 г.-23 декабря 2014 г. Получение мутантных форм пенициллинацилазы и Д-аминопептидазы с улучшенными каталитическими свойствами при помощи методов компьютерного дизайна и генетической инженерии
Результаты этапа: Изучена взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами в суперсемействах Ntn-гидролаз и пенициллин-связывающих белков, путем целенаправленного изменения структуры пеницилинацилазы из E.coli и D-аминопептидазы из O.anthropi получены мутантные формы с улучшенными каталитическими свойствами и стабильностью. Для дизайна ферментов использован разрабатываемый авторским коллективом комплексный подход, основанный на интеграции компьютерных и экспериментальных методов. Методы системной биологии и биоинформатического анализа суперсемейств ферментов были использованы для выявления аминокислотных остатков, при модификации которых можно целенаправленно изменять функциональные свойства, методы молекулярного моделирования применены для создания in silico библиотек мутантов, содержащих рекомендованные замены, методы вычислительной химии использованы для предсказания функциональных свойств мутантов. Компьютерный скрининг на основе теоретических критериев реакционной способности фермент-субстратных комплексов позволил отобрать наиболее перспективные мутанты для получения методами белковой инженерии и экспериментального исследования. С использованием разработанного подхода получены мутанты пенициллинацилазы из E.coli, существенно превышающие фермент своей стабильностью в щелочной среде, необходимой для эффективного проведения ферментативного синтеза пептидов и пептидомиметиков. В результате дизайна D-аминопептидазы из O.anthropi получены мутанты фермента с расщиренной субстратной специфичностью.
2 1 января 2015 г.-23 декабря 2015 г. Получение мутантных форм пенициллинацилазы и Д-аминопептидазы с улучшенными каталитическими свойствами при помощи методов компьютерного дизайна и генетической инженерии
Результаты этапа: В 2015 г. была продолжена разработка комплексного метода для дизайна функциональных свойств ферментов, основанного на интеграции методов молекулярного моделирования, системной биологии, компьютерного скрининга и экспериментальной белковой инженерии, созданы in silico библиотеки мутантов второго поколения пенициллинацилазы из Escherichia coli и Д-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi, проведен их компьютерный скрининг в соответствии с требованиями теоретической химии к реакционноспособным фермент-субстратным комплексам и отобраны наиболее перспективные мутанты для получения методами генетической инженерии и экспериментального исследования. Каталитические свойства полученных мутантов пенициллинацилазы были изучены в реакциях препаративного синтеза пептидов, а также разделения рацематов аминоспиртов и проведено их сравнение с ферментом дикого типа. Получены мутанты пенициллинацилазы, стабильность которых превышает стабильность фермента дикого типа в щелочной среде в 47 и 195 раз. Наряду со стабилизацией к инактивирующему действию щелочной среды созданные являлись также намного более устойчивыми к инактивирующему действию высоких концентраций субстратов. Стабилизация пенициллинацилазы к этому инактивирующему фактору имеет важное практическое значение для препаративного ферментативного синтеза пептидов и пептидомиметиков. Использование стабилизированных мутантов пенициллинацилазы позволяет увеличить выход пептидов, содержащих остаток D-фенилглицина, вплоть до 80% даже в эквимолярной смеси исходных субстратов, в то время как при использовании пенициллинацилазы дикого типа превращение составляет менее 17%. 2015 году получены принципиально важные результаты по созданию мутантных препаратов пенициллинацилазы, обладающих высокой энантиоселективностью в реакциях ферментативного ацилирования аминоспиртов. Получен мутантный препарат пенициллинацилазы, энантиоселективность которого по отношению к аминоспиртам превышает таковую для фермента дикого типа в 250 раз. Экспериментально показано, что созданный мутант (Е=700) позволяет провести разделение рацемата и получить энантиомерно чистый фенилаланинол с энантиомерным избытком 99,7%, в то время как пеницициллинацилаза дикого типа (Е=2.8) совершенно непригодна для этих целей. Получены мутанты второго поколения D-аминопептидазы (DAP) с расширенной субстратной специфичностью, способные превращать субстраты с объемными и разветвленными гидрофобными радикалами. По результатам работы опубликована статья T.A. Shcherbakova, N.V. Panin, D.A. Suplatov, I.V. Shapovalova, V.K. Svedas, The ?D484N mutant of penicillin acylase from Escherichia coli is more resistant to inactivation by substrates and can effectively perform peptide synthesis in aqueous medium, J. Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2015, 112, 66-68. DOI: 10.1016/j.molcatb.2014.11.015, разрабатываемый метод дизайна функциональных свойств ферментов представлен в устных докладах на двух конференциях: Суплатов Д.А., Панин Н.В., Швядас В.К., Халиуллин И.Г. «Рациональный дизайн ферментов с использованием методов биоинформатики и молекулярного моделирования» на VIII Московском международном конгрессе «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» и Suplatov D., Panin N., Shcherbakova T., Khaliullin I., Svedas V. «Bioinformatic analysis of diverse protein superfamilies to design improved enzymes» на международной конференции Moscow Conference on Computational Molecular Biology (MCCMB’15).
3 1 января 2016 г.-23 декабря 2016 г. Получение мутантных форм пенициллинацилазы и Д-аминопептидазы с улучшенными каталитическими свойствами при помощи методов компьютерного дизайна и генетической инженерии
Результаты этапа: Изучена взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами в суперсемействах Ntn-гидролаз и пенициллин-связывающих белков. Путем целенаправленного изменения структуры пеницилинацилазы из E.coli и D-аминопептидазы из O.anthropi получены мутантные формы с улучшенными каталитическими свойствами и стабильностью. Для дизайна ферментов использован разрабатываемый авторским коллективом комплексный подход, основанный на интеграции компьютерных и экспериментальных методов. Методы системной биологии и биоинформатического анализа суперсемейств ферментов были использованы для выявления аминокислотных остатков, при модификации которых можно изменять функциональные свойства ферментов. Методы молекулярного моделирования применены для создания in silico библиотек мутантов, содержащих рекомендованные замены, методы вычислительной использованы для предсказания функциональных свойств мутантов. Компьютерный скрининг на основе теоретических критериев реакционной способности фермент-субстратных комплексов позволил отобрать наиболее перспективные мутанты для получения методами белковой инженерии и экспериментального исследования. С использованием разработанного подхода получены мутанты пенициллинацилазы из E.coli, существенно превышающие фермент дикого типа своей стабильностью в щелочной среде, необходимой для эффективного проведения ферментативного ацилирования аминосоединений в водной среде. Показано, что бетаD484N мутант пенициллинацилазы, в отличие от фермента дикого типа, также не подвержен инактивирующему действию высоких концентраций субстрата, что позволяет существенно более эффективно проводить препаративный синтез пептидов. В результате дизайна D-аминопептидазы из O.anthropi получены мутанты фермента с расширенной субстратной специфичностью, способные превращать производные аминокислот с объемным боковым радикалом (D-фенилаланина и D-лейцина).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".