![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
1. Создание новых генно-инженерных векторов на основе геномов вирусов растений и получение химерных вирусных частиц, несущих чужеродные иммуногенные эпитопы на поверхности вириона, и/или получение вирусоподобных частиц на основе химерных белков вирусов растений, слитых с чужеродными иммуногенными эпитопами, что открывает перспективу производства вакцинных иммуногенов в растениях. 2. Изучение возможности создания наноплатформ для получения вакцинных и диагностических нанокомплексов на основе комплексов структурно модифицированных вирусных и вирусоподобных частиц, полученных при термической обработке нативных фитовирусов (Х-вируса картофеля, вируса мозаики альтернантеры, вируса штриховатой мозаики ячменя). Получение комплексов «наноплатформа-эпитопы патогена» и «наноплатформа – полимер - эпитопы патогена», которые позволят принципиально упростить и ускорить процесс производства безопасных вакцин различной природы 3. Разработка новых модификаций внелабораторных иммунохроматографических методов диагностики вирусов растений и мониторинг вирусных заболеваний сельскохозяйственных культур.
Создание на базе модифицированных вирионов фитовирусов сферических частиц («СЧ-платформ»), экспонирующих антигены патогенов для получения кандидатных вакцин -иммуногенных комплексов «СЧ-антиген». Ранее на основе палочковидных вирионов вируса табачной мозаики (ВТМ) нами был получен новый тип биогенных сферических частиц (СЧ) - платформ (носителей) для создания функционально активных комплексов. Было показано, что СЧ обладают высокой стабильностью и имунногенностью и могут быть использованы в качестве универсальной платформы-адьюванта при создании вакцин. На основе сферических частиц был создан образец кандидатной вакцины против краснухи и проведена наработка препаратов комплекса СЧ – антигены вируса краснухи в количествах необходимых для начала доклинических испытаний За отчетный период в рамках НИОКР «Доклинические исследования вакцины против краснухи, полученной на основе структурно модифицированных вирусов растений в качестве универсальной платформы - адъюванта» в рамках федеральной целевой программы «Фарма-2020» было проведено сравнение иммуногенности кандидатной вакцины со следующими препаратами: свободным тетраэпитопом A гликопротеина E1 вируса краснухи, тетраэпитопом A вместе с наиболее распространенным в клинической практике адъювантом – гидроксидом алюминия (существующей зарегистрированной вакциной против краснухи) и нулевым контролем – стерильным физиологическим раствором. Изучено влияние путей введения лекарственного средства на иммуногенность – внутримышечного и внутрибрюшинного. Результаты исследования показали статистически значимое превышение титров антител у животных при использовании кандидатной вакцины как при внутримышечном, так и при внутрибрюшинном введении. Таким образом, достоверно продемонстрирована высокая иммуногенность вакцины против краснухи, полученной на основе структурно модифицированных вирусов растений в качестве универсальной платформы – адъюванта на животной модели. Разработка доступного иммунохроматографического экспресс-метода для массовой диагностики вирусов растений и мониторинг вирусных заболеваний сельскохозяйственных культур. Исследованы молекулярно-биологические свойства изолятов вируса оспы сливы (ВОС) штамма D, обнаруженных в насаждениях косточковых культур на территории Европейской России. С помощью филогенетического анализа частичных и полных последовательностей их генома показано, что имела место неоднократная интродукция в Россию изолятов этого штамма из стран Восточной и Южной Европы. При анализе полногеномных последовательностей российских изолятов ВОС штамма W обнаружено широкое распространение феномена внутриштаммовой рекомбинации, являющейся важным источником высокой генетической изменчивости изолятов этого штамма. Разработана усовершенствованная методика препаративного выделения вируса оспы сливы, обеспечивающая высокий выход очищенного вируса с полноразмерным белком оболочки. Показано, что среди природных изолятов штаммов C и CR широко распространен универсальный эпитоп с мутацией D94E (94ERDVDAG100), который не распознается моноклональными антителами 5В, использующимися в ИФА при диагностики вируса, что создает потенциальную угрозу получения ложноотрицательных результатов при мониторинге заболеваний растений.. Создание фитовирусов-векторов для использования нетрансгенных растений как фабрик продукции целевых белков и разработка доступного иммунохроматографического экспресс-метода для массовой диагностики вирусов растений С целью разработки диагностической системы ранее был создан агробактериальный вектор, содержащий репликационный и транспортный аппарат эффективно накапливающегося в растениях палочковидного вируса табачной мозаики и ген белка оболочки чрезвычайно плохо накапливающегося в растениях сферического вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК). Показано, что экспрессия этого вектора в растениях приводит к накоплению искусственного сферического химерного вируса картофеля, состоящего из РНК спирального тобамовируса и белка оболочки сферического вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК). Показано, что химерный вирус размножается в зараженном растении в 800 раз эффективнее, чем природый изолят ВСЛК, а антитела к дикому типу ВСЛК узнают химерный вирус с той же чувствительностью, что и природный изолят, что позволяет, эффективно накапливать химерный вирус для иммунизации и получения антисывороток к ВСЛК и снимает ограничения на разработку диагностических систем. С использованием химерного вируса и полученных к нему антител изготовлены экспериментальные диагностические тест-полоски с чувствительностью, достаточной для определения наличия вируса ВСЛК в зараженных растениях. Эти тест полоски в настоящее время проходят испытания и сравниваются с зарубежными коммерческими аналогами.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
4 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Суперпродукция чужеродных белков в растениях c помощью вирусных векторов для создания вакцинных и диагностических препаратов |
Результаты этапа: Создание на базе модифицированных вирионов фитовирусов наноплатформ для получения иммуногенных комплексов с нативными вирусными частицами. Ранее были изучены структурные особенности сферических частиц (СЧ), образуемых при термической перестройке вируса табачной мозаики (ВТМ). Было показано, что СЧ являются универсальной платформой для презентации различных белков и обладают адъювантными свойствами. За отчетный период основе СЧ с использованием рекомбинантных белков - антигенных детерминант вируса краснухи создан образец кандидатной вакцины против краснухи. Проведена наработка препаратов комплекса СЧ –антигены вируса краснухи в количествах необходимых для начала доклинических испытаний в рамках НИОКР «Доклинические исследования вакцины против краснухи, полученной на основе структурно модифицированных вирусов растений в качестве универсальной платформы - адъюванта» в рамках федеральной целевой программы «Фарма-2020». Получен новый тип сферических биогенных частиц (СЧ) на основе Х вируса картофеля, образующихся в результате нагревания при определенных температурах (90°С) нитевидных вирионов со спиральной структурой (СЧ-ХВК). Обнаружено, что размер СЧ-ХВК в значительно меньшей степени зависит от концентрации исходного нативного вируса по сравнению с СЧ, полученными из вируса табачной мозаики (ВТМ). Накоплены два вида препаратов СЧ-ХВК с размерами диаметра от 50 до 150 нм и 150-300 нм. Проведен сравнительный анализ свойств и структуры белка оболочки в составе нативного ХВК и белка в составе сферических частиц (СЧ-ХВК). Показано, что в отличие от нативного БО ХВК белок в составе СЧ-ХВК имеет значительно меньшее количество a-спиралей и большее количество β-структур. Кроме того, показано, что СЧ-ХВК взаимодействуют с тиофлавином Т, что может являться признаком амилоидоподобной структуры СЧ-ХВК, так же как и СЧ, полученных из ВТМ. Проведены предварительные эксперименты по изучению адсорбционных свойств СЧ-ХВК и показана возможность образования комплексов СЧ-ХВК – чужеродный белок. Продукция в растениях химерных вирусных частиц, несущих чужеродные эпитопы на поверхности вириона. Проведены работы по изучению возможности формирования в растениях палочковидных вирионов с двумя экспонированными на поверхности чужеродными гидрофильным и гидрофобным антигенами. Рекомбинантные вирусы, созданные на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ) и несущие на поверхности химерных частиц консервативный антиген вируса гриппа А fp (пептид слияния гемагглютинина) и 3 варианта антигена M2e, использовались в серии смешанных заражений методом агроинокуляции растений Nicotiana benthamiana. Показано, что развитие и симптоматика подобных смешанных инфекций весьма существенно отличаются от развития и симптоматики при раздельных заражениях отдельными векторами - ВТМ-М2е-cys, ВТМ-М2е-ser, ВТМ-М2е-ala и ВТМ-fp соответственно, и ни в одном из экспериментов не наблюдалается реверсия к ранее изученным фенотипам инфекций ВТМ-М2е и ВТМ-fp. Подтверждена одновременная и эффективная системная экспрессия обоих антигенов (слитые белки с молекулярной массой 22 и 24 кДа), что позволяет рассчитывать на формирование и успешное выделение палочковидных вирионов с двумя экспонированными чужеродными гидрофильным и гидрофобным антигенами. Подробно изучена динамика и выявлен ряд различий в накоплении рекомбинантных структурных белков всех 3-х упомянутых векторов серии ВТМ-М2е в инокулированных и системных листьях растений, принадлежащих к широкому кругу хозяев. Планируется изучение взаимного соотношения эпитопов и их распределения по химерным частицам. Создание фитовирусов-векторов для использования нетрансгенных растений как фабрик продукции целевых белков. Ранее был создан агробактериальный вектор, содержащий репликационный и транспортный аппарат эффективно накапливающегося в растениях палочковидного вируса табачной мозаики и ген белка оболочки чрезвычайно плохо накапливающегося в растениях сферического вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК). Показано, что экспрессия этого вектора в растениях приводит к накоплению искусственного сферического химерного вируса картофеля, состоящего из РНК спирального тобамовируса и белка оболочки сферического вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК). Показано, что химерный вирус размножается в зараженном растении в 800 раз эффективнее, чем природый изолят ВСЛК, а антитела к дикому типу ВСЛК узнают химерный вирус с той же чувствительностью, что и природный изолят, что позволяет, эффективно накапливать химерный вирус для иммунизации и получения антисывороток к ВСЛК и снимает ограничения на разработку диагностических систем. С использованием химерного вируса и полученных к нему антител изготовлены экспериментальные диагностические тест-полоски с чувствительностью, достаточной для определения наличия вируса ВСЛК в зараженных растениях. Мониторинг вирусных заболеваний сельскохозяйственных культур. В рамках изучения генетического разнообразия вируса оспы сливы (ВОС) в России и на территории бывшего СССР выявлены 2 природных изолята ВОС, относящихся к штамму Rec - K28 и Kisl-1pl. Последовательности полных геномов этих изолятов определены посредством пиросеквенирования и депонированы в базу данных GenBank (KF472134 и KM273015). Рекомбинационный анализ полногеномных последовательностей K28 и Kisl-1pl, а также 7 других изолятов штамма Rec, доступных в GenBank, с помощью пакета программ RDP4 выявил наличие двух междуштаммовых рекомбинационных событий: в 3’- и, впервые, в 5’-конце генома всех исследованных изолятов штамма Rec в районе генов P1 и HcPro. Определены полные последовательности геномов 8 российских изолятов ВОС штамма W (Winona), обнаруженных ранее в насаждениях косточковых культур в различных регионах Европейской России. Рекомбинационный анализ полногеномных последовательностей этих изолятов, а также 5 других изолятов штамма W, доступных в GenBank, с помощью пакета программ RDP4 впервые выявил наличие и широкое распространение внутриштаммовых рекомбинационных событий. Из 13 исследованных изолятов 9 оказались рекомбинантами. В некоторых изолятах обнаружены множественные и перекрывающиеся рекомбинационные события. Большинство брейкпойнтов картировано в регионе между генами P1 и CI. Полученные результаты показывают важную роль рекомбинации в формировании изменчивости ВОС и позволяют существенно уточнить представления об его эволюционной истории. | ||
5 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Суперпродукция чужеродных белков в растениях c помощью вирусных векторов для создания вакцинных и диагностических препаратов |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".