![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
В ходе выполнения второго этапа был проведен детальный анализ транскриптома L.pyrrhocorrys H10. Анализ показал, что все гены(криптогенны) максикольцевого кинетопластного генома транскрибируются, но представленность матричных РНК существенно разнится для каждого гена. Как и было показано на 1ом этапе, мажорные транскрипты соответствуют генам 12S РНК, 9S РНК и COI. Гены NADH-дегидрогеназного комплекса представлены транскриптами, количество которых на 2 порядка меньше, чем у мажорных. Гены цитохромоксидазного комплекса представлены промежуточным количеством транскриптов. Совершенно неожиданным оказалось присутствие в транскриптоме большого количества протяженных транскриптов, считываемых с миникольцевых молекул. Ранее было показано, что с миниколец считываются т.н. гидовые РНК, необходимые для процесса уридилового редактирования, но их размер составляет не более 50 нуклеотидов, тогда как выявленные транскрипты имеют размер до 1000 нуклеотидов. При этом, миникольца не имеют протяженных рамок считывания и не кодируют каких либо белковых молекул. Еще одной особенностью этих транскриптов оказалась значительная гетерогенность первичной структуры, так называемой консервативной области миниколец, что ранее не отмечалось другими исследователями (возможно из-за малого количества анализировавшихся миниколец). С помощью разработанной в рамках данного проекта компьютерной программы удалось предположить структуру редактируемых сайтов в криптогенах. Часть предсказанных структур была проверена экспериментально, в частности, для криптогенна COIII. Проведена оптимизация метода выделения митохондрий из другого вида трипаносоматид (Wallecemonas saldae WSD), филогенетически далеко отстоящего от L. pyrrhocorrys. Подготовлены три варианта препаратов РНК из клеток, подвергшихся температурному шоку (+4 и 37оС).
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 7 марта 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Сравнительный анализ митохондриального транскриптома у инсектных трипаносоматид на разных стадиях клеточного цикла и при различных условиях выращивания |
Результаты этапа: В ходе работы нами был успешно отработан метод получения митохондриальной фракции L. pyrhocorrys H10. РНК из митохондриальной фракции клеток, выращенных в условиях с присутствием и без присутствия глюкозы, была использована для приготовления библиотек тотальной и polyA-обогащенной фракций. В результате были получены 4 библиотеки: total-Glc+, total-Glc-, polyA-Glc+, polyA-Glc-. Эти библиотеки были секвенированы на платформе Illumina MiSeq (парные чтения, длина чтения 250 п.н.). Анализ результатов секвенирования показал: 1. Гены митохондриального генома транскрибируются на существенно разных уровнях: во всех фракциях преобладают транскрипты генов 9S рРНК, 12S рРНК и COI. 2. Открытые рамки считывания MURF5, MURF1, MURF2 не транскрибируются, по крайней мере, в данных условиях роста. 3. У клеток, выращенных в присутствии глюкозы, уровень транскрипции митохондриальных генов ниже, чем у клеток, выращенных без глюкозы. | ||
2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Сравнительный анализ митохондриального транскриптома у инсектных трипаносоматид на разных стадиях клеточного цикла и при различных условиях выращивания |
Результаты этапа: В ходе выполнения второго этапа был проведен детальный анализ транскриптома L.pyrrhocorrys H10. Анализ показал, что все гены(криптогенны) максикольцевого кинетопластного генома транскрибируются, но представленность матричных РНК существенно разнится для каждого гена. Как и было показано на 1ом этапе, мажорные транскрипты соответствуют генам 12S РНК, 9S РНК и COI. Гены NADH-дегидрогеназного комплекса представлены транскриптами, количество которых на 2 порядка меньше, чем у мажорных. Гены цитохромоксидазного комплекса представлены промежуточным количеством транскриптов. Совершенно неожиданным оказалось присутствие в транскриптоме большого количества протяженных транскриптов, считываемых с миникольцевых молекул. Ранее было показано, что с миниколец считываются т.н. гидовые РНК, необходимые для процесса уридилового редактирования, но их размер составляет не более 50 нуклеотидов, тогда как выявленные транскрипты имеют размер до 1000 нуклеотидов. При этом, миникольца не имеют протяженных рамок считывания и не кодируют каких либо белковых молекул. Еще одной особенностью этих транскриптов оказалась значительная гетерогенность первичной структуры, так называемой консервативной области миниколец, что ранее не отмечалось другими исследователями (возможно из-за малого количества анализировавшихся миниколец). С помощью разработанной в рамках данного проекта компьютерной программы удалось предположить структуру редактируемых сайтов в криптогенах. Часть предсказанных структур была проверена экспериментально, в частности, для криптогенна COIII. Проведена оптимизация метода выделения митохондрий из другого вида трипаносоматид (Wallecemonas saldae WSD), филогенетически далеко отстоящего от L. pyrrhocoris. Подготовлены три варианта препаратов РНК из клеток, подвергшихся температурному шоку (+4 и 37оС). Препараты переданы для секвенирования. | ||
3 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Сравнительный анализ митохондриального транскриптома у инсектных трипаносоматид на разных стадиях клеточного цикла и при различных условиях выращивания |
Результаты этапа: Общая характеристика транскриптома L. pyrrhocoris была получена на предыдущих этапах проекта, поэтому основное внимание было уделено анализу транскриптома у Wallacemonas sp. WSD. Анализ экспрессии максикольцевых генов W. sp. WSD проводился по данным секвенирования трех библиотек РНК: полиА-обогащенная РНК из клеток, выращенных при нормальных условиях (+RT); полиА-обогащенная РНК из клеток после теплового шока (+Heat); полиА-обогащенная РНК из клеток после холодового шока (+Cold). При анализе дифференциальной экспрессии генов нормирование проводилось на долю ридов библиотеки, попадающих на максикольцо, а также на уровень экспрессии гена ND7. Ряд генов максикольца не экспрессируется в исследуемых образцах. К таким генам относятся A6, G4, murf5. Экспрессия данных генов поддержана на уровне 0-10 ридов. Экспрессия генов рРНК (9S, 12S) не выявляется в следствие того, что используется полиА обогащение. Возможно, это является причиной не выявления экспрессии A6, против чего говорят наши данные для L. pyrrhocoris H10, где видно, что транскрипт криптогена А6 имеет полиА последовательность на 3’-конце транскрипта. Что же касается генов murf5 и G4, то в данных локусах максикольца W. sp. WSD находятся негомологичные соответствующим синтенным локусам других трипаносоматид структуры. Так, ранее нами подробно изучен локус между COI и ND4, содержащий у других видов редактируемый криптоген G4. В случае W. sp. WSD в данном месте максикольца обнаруживается СА-богатый блок, не характерный для других видов. В каждом образце гены COI, COII, COIII и cyb являются высоко экспрессируемыми. В ранжированном списке данные гены всегда экспрессируются на уровне, превосходящим нормировочный ген ND7. К генам с относительно низким уровнем экспрессии относятся ND4, ND5, murf1, G5, G3. Последние два гена редактируются (см. ниже), однако, полнофункциональной ОРС не выявляется. Экспрессия генов ND8, murf2, ND1, ND9 сильно меняется в зависимости от условий выращивания клеток. Так экспрессия гена ND8 возрастает более чем в 9 раз в образце, подвергнутом холодовому шоку, экспрессия гена murf2 возрастает более чем в 12 раз в образцах, подвергнутых стрессовым условиям (в сравнении с +RT). Экспрессия гена ND1 несколько возрастает в стрессовых условиях.. Экспрессия rps12 не меняется по всех образцах. Для анализа редактирования максикольцевых генов мы применили разработанный нами инструмент T-Aligner, который совмещает в себе функции картировщика ридов и автоматического инструмента для анализа и визуализации редактируемых сайтов, а также реконструкции открытых рамок считывания. Часть генов максикольца W. sp. WSD утратила необходимость в редактировании. Так, ранее методами секвенирования по Сэнгеру нами было показано, что криптоген ND8, который является криптогеном у других видов, у W. sp. WSD практически полностью утрачивает редактируемый домен. В данном исследовании с помощью T-Aligner мы подтверждаем, что редактируемый домен ND8 очень короткий и захватывает лишь первые 11 нукелотидов пре-мРНК. Редактирование происходит только в образце после холодового шока, и не просиходит в других образцах. Следует отметить, что только в случае образца после холодового шока наблюдается содержащаяя ОРС мРНК, а также что наличие редактирования коррелирует с возрастанием уровня экспрессии данного гена. Ген ND1 не требует редактирования у всех известных видов, у W. sp. WSD также содержит полную рамку считывания, однако T-Aligner выявляет 3 сайта редактирования в 3’-НТО мРНК данного гена, которые, возможно, имеют регуляторный характер . Криптоген rps12 редактируется по всей длине траскрипта, сходный паттер редактирования наблюдается во всех образцах . Ген COIII у W. sp. WSD утрачивает редактируемый домен и содержит полную рамку считывания. Интересной особенность максикольцевого генома W. sp. WSD является отсутствие экспрессии большинства криптогенов (G4, G5, ND9, A6) либо крайняя степень редукции длины редактируемого домена (COIII, ND8), что, как мы показали при анализе миникольцевого генома, коррелирует со снижением гетерогенности миникольцевой популяции. Заключение. Проведено секвенирование (NGS) трех полиА, цепь-специфичных библиотек для W. sp. WSD. С помощью специально разработанного нами интсрумента T-Aligner проанализированы уровни экспрессии и паттерны редактирования максикольцевых генов. Выявлены новые транскрипционные единицы, не синтенные максикольцам других видов. Показано отсутствие экспрессии ряда криптогенов. Выявлено дифференциальное редактирование домена ND8. Выявлено редактирование 3’-НТО гена ND1. Показана полная утрата редактирования в гене COIII. Подтвержена утрата криптогена G4 в максикольце. Второй частью работы данного этапа являлся анализ транскриптома миникольцевого компонента митохондриального генома L. pyrrhocoris. 1. Анализ консервативных областей миниколец. . Обычно длина КО видоспецифична и имеет протяженность от 90 до 110 пн. Таких последовательностей оказалось более 1000. Проведенное выравнивание показало, что идентифицированные последовательности имеют значительную гетерогенность по первичной структуре (варьируют от 2 до 10 нуклеотидов на 117 нуклеотидов КО). CSB I-III абсолютно консервативны, при этом число вариабельных позиций составило 54 во всей КО. Исходя из числа ридов, поддерживающих тот или иной вариант первичной структуры, можно предположить, что в популяции миниколец существует сильная дифференциация по представленности вариантов в ассоциате кпДНК. Имеется группа мажорных вариантов (порядка 9 – 14, поддержка более, чем 100 ридами) и существенная часть представлена редкими и уникальными вариантами. Можно отметить, что у Wallacemonas sp WSD (анализ генома проводился параллельно) гетерогенность КО протяженностью 102 нуклеотида выражена значительно меньше (10 вариабельных позиций). При этом уровень поддержки ридами сравнительно ровный( в среднем от 10 до 35). 2. Была предпринята попытка собрать полноразмерные кольца, что и было успешно сделано. Было собрано более 50 миниколец длиной 1150 – 1300 пн (данные для 26 колец доступны в GenBank). Для того, чтобы убедиться в правильности сборки, в нескольких собранных кольцах были выбраны специфические последовательности, которые использовали для синтеза специфических праймеров для ПЦР. Выбор определялся по степени поддержки ридами последовательности нуклеотидов КО (т.е. мажоры и миноры). Полученные ПЦР продукты были секвенированы по Сэнгеру. Последовательности были выравнены с собранными миникольцами и оказалось, что они полностью идентичны. Учитывая, что сборка проводилась на РНК библиотеке, мы делаем заключение, что миникольцевые молекулы (по меньшей мере, собранные) полностью транскрибируются по всей длине. Анализ структуры собранных миниколец показал, что они имеют 2 симметрично расположенные КО, что не характерно для молекул такого размера, по меньшей мере, у ближайших родственников – лейшманий . Димерный вариант структуры миниколец был также описан еще для нескольких представителей «медленно эволюционирующей» группы – Crithidia fasciculate CF-C13 в GeneBank M19266, а также у Wallaceina brevicola и Wallaceina inconstans ( №№Z32854, AF121798, AF124056).Мультимерный вариант структуры миниколец найден и в других группах трипаносоматид, в частности, у трипаносом T.lewisi (№№M17995,17996), T. carassii (№S82304 ) и у Herpetomonas pessoai ( AF064359-064399 по 2 КО, у T.cruzi и T.rangeli по 4 . КО делят миникольцо на две(четыре) равные части, которые могут существенно различаться по последовательности нуклеотидов, в частности, это касается обогащения одной из частей АТ парами. Можно предполагать, что все миникольца (или большая их часть) у представителей медленно эволюционирующей группы, кроме представителей рода Leishmania, построены по «димерному» плану. Заключение. 1) Миникольцевые ДНК L.pyrrhocoris имеют две симметрично расположенные консервативные области. 2) миникольцевые ДНК L. pyrrhocoris транскрибируются полностью (по всей длине) также как и у диксенных видов (Trypanosoma brucei и Leishmania tarentolae). 3) Гетерогенность первичной структуры КО имеет видоспецифический характер. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".