ИСТИНА

Вироиды, инфекционные агенты, являющиеся возбудителями болезней растений, представляют собой короткие кольцевые РНК, не кодирующие каких-либо белковых продуктов. Все функции, необходимые для репликации вироида в зараженных клетках и распространения инфекции, выполняют клеточные белки. Объектом настоящего исследования является вироид веретеновидности клубней картофеля, типовой представитель семейства Pospiviroidae. Известно, что в репликации вироидов данного семейства участвует клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза II. Вместе с тем, остается неясным, за счет каких клеточных факторов осуществляются внутриклеточный (в первую очередь - ядерно-цитоплазматический) и межклеточный транспорт вироидной РНК. Известен ряд клеточных белков, способных связывать РНК вироида, но функциональное значение этих взаимодействий остается непонятным. Целью данного проекта является исследование молекулярных взаимодействий между вироидной РНК и белками растений-хозяев, определяющих вирулентность вироида и его способность к внутриклеточному и межклеточному транспорту. Будет изучен ряд клеточных белков, для которых взаимодействие с вироидной РНК показано или предполагается на основании косвенных данных, а также проведен поиск новых белков растений-хозяев, для которых взаимодействие с вироидной РНК описано не было. План работ включают генетические, биохимические и клеточные подходы, которые позволят экспериментально охарактеризовать соответствующие молекулярные взаимодействия как in vitro, так и in vivo, а также пролить свет на функции отдельных белков в развитии вироидной инфекции.

Проведено исследование связывания РНК вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) с рекомбинантными белками VirP1-C и Nt-4/1. Показано, что белок Nt-4/1 в присутствии конкурирующей двуцепочечной РНК избирательно связывал РНК ВВКК, тогда как белок VirP1-C при избытке конкурирующей тРНК преимущественно связывает одну, но не другую половину шпилечной структуры ВВКК. Выявлено, что белок Nt-4/1 предпочтительно связывает двуцепочечные РНК, представляющие собой несовершенные дуплексы. С использованием делеционных и точечных мутантов картирован РНК-связывающий сайт белка Nt-4/1. Изучена внутриклеточная локализация белка Nt-4/1. Обнаружено, что Nt-4/1-GFP детектируется в сферических тельцах, локализующихся в цитоплазме и способных к внутриклеточному движению с участием актинового цитоскелета, а также вблизи плазмодесм. Показано, что белок Nt-4/1 обладает способностью к нуклео-цитоплазматическому транспорту. В последовательности белка Nt-4/1 картирован неканонический сигнал ядерного экспорта. Идентифицирован ранее неизвестный вироид-связывающий белок Bap31, способный взаимодействовать не только с РНК ВВКК, но и с белком Nt-4/1. В последовательности Bap31 картирован район, отвечающий за связывание с РНК. Исследована роль белка Nt-4/1 в развитии вироидной инфекции. Показано, что в растениях, в которых уровень экспрессии Nt-4/1 снижен с помощью вирус-индуцируемого умолкания генов, дальний транспорт вироида из инокулированных листьев в листья, находящиеся непосредственно над инокулированным, был гораздо эффективнее, чем в контрольных растениях с природным уровнем экспрессии Nt-4/1. С помощью трансгенных растений, несущих маркерный ген GUS под контролем промотера гена Nt-4/1, исследована тканеспецифичность экспрессии гена Nt-4/1 и регуляция его активности в онтогенезе. Получены данные о том, что промотер гена Nt-4/1 активен в проводящих пучках листьев и семядолей на определенной стадии развития растения, а также проявляет активность в черешках и стебле. В молодых и мелких проводящих пучках экспрессия Nt-4/1 детектировалось преимущественно в клетках первичной флоэмы. В целом, данные, полученные при выполнении работ по проекту, говорят о том, что белок Nt-4/1 участвует в системном транспорте РНК патогенов или патоген-специфических малых РНК. В отсутствие вирусных/вироидных патогенов роль белка Nt-4/1 может быть связана с переносом по флоэме мРНК растения и/или РНК-компонентов системы РНК-интерференции. В соответствии с этой гипотезой обнаружено, что белок Nt-4/1 способен связывать клеточные РНК, являющиеся предшественниками микро-РНК.