Пост-транскрипционный сайленсинг в защитном ответе растений на патогены: новые клеточные и вирусные белки-модуляторы функций малых РНК НИР

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 8 июля 2014 г.-31 декабря 2014 г. Пост-транскрипционный сайленсинг в защитном ответе растений на патогены: новые клеточные и вирусные белки-модуляторы функций малых РНК
Результаты этапа: Исследования клеточных и вирусных белков-модуляторов функций малых РНК велись в нескольких направлениях. Проведен скрининг библиотеки растительной кДНК в дрожжевой двугибридной системе; выявлены клеточные белки, способные взаимодействовать с белком Nt-4/1. Получены трансгенные растения с пониженным уровнем экспрессии белка Nt-4/1. Отработаны методы иммунопреципитации белков Nt-4/1 и р42 из растительных экстрактов. Исследована способность вирусных белков ТБГ1 и ЦББ супрессировать РНК-сайленсинг в трансгенных растениях. Клонированы гены ТБГ1 вирусов HGSV и SSMAV. С использованием рекомбинантного вирусного генома показано, что клеточный белок Nt-4/1 оказывает существенное влияние на системный транспорт вирусной инфекции в растении. С помощью секвенирования нового поколения показано, что экспрессия Nt-4/1 в составе вирусного генома значительным образом меняет профиль накопления вирус-специфических малых РНК в растении.
2 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Пост-транскрипционный сайленсинг в защитном ответе растений на патогены: новые клеточные и вирусные белки-модуляторы функций малых РНК
Результаты этапа: Поведен анализ взаимодействий in vitro белка Nt-4/1 и его белка-партнера, идентифицированного ранее в дрожжевой двугибридной системе, с использованием плазмонного резонанса. С помощью флуоресцентной микроскопии показано, что ко-экспрессия данных белков в клетках растений ведет к изменению внутриклеточной локализации Nt-4/1. Показано, что в трансгенных растениях N.tabacum с пониженным уровнем экспрессии Nt-4/1 подавлено проникновение вируса погремковости табака в апикальную меристему стебля. Проведено выделение комплексов, содержащих белки Nt-4/1 и р42, из клеток растений, их белковые компоненты идентифицированы с помощью масс-спектрометрии. Показано, что РНК-связывающая активность белка Nt-4/1 вносит вклад в его влияние на системный вирусный транспорт, однако не является единственной детерминантой этого влияния. С использованием секвенирования транскриптомов методами нового поколения проведено исследование влияния белка Nt-4/1 на экспрессию клеточных генов. В экспериментальной системе, основанной на комплементации межклеточного транспорта вируса морщинистости турнепса не выявлена способность ЦББ и ТБГ1 супрессировать РНК-сайленсинг. Проведено исследование эволюции структуры генов 4/1 у низших растений. Показано, что хеликазный домен, родственный репликативным хеликазам вирусов растений, обнаруживается в составе белка, кодируемого рядом ретротранспозонов насекомых, и, подобно соответствующим доменам белков фитовирусов, обладает способностью супрессировать РНК-сайленсинг.
3 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Пост-транскрипционный сайленсинг в защитном ответе растений на патогены: новые клеточные и вирусные белки-модуляторы функций малых РНК
Результаты этапа: Проведено изучение белок-белковых взаимодействий с участием Nt-4/1 in vivo. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показано, что в растительных клетках слитный белок NtPBL-mRFP локализован в полигональной сети эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и малых ЭПР-ассоциированных тельцах, не являющихся структурами аппарата Гольджи. В экспериментах по ко-экспрессии NtPBL-mRFP и Nt-4/1-GFP показано, что Nt-4/1-GFP-содержащие цитоплазматические тельца ко-локализуются с ЭПР-ассоциированными тельцами, содержащими NtPBL-mRFP, что согласуется с данными о взаимодействии белков NtPBL и Nt-4/1, полученными другими методами. Проведен анализ взаимодействия Nt-4/1 с белком Nb-CPL3 методом ко-экспрессии в клетках растений. Показано, что CPL3С-mRFP, представляющий собой слитый с mRFP N-концевой район белка Nb-CPL3, локализуется диффузно в цитоплазме и нуклеоплазме. При ко-экспрессии CPL3С-mRFP и Nt-4/1-GFP обнаружено, что CPL3С-mRFP локализуется таким же образом, как и в отсутствие Nt-4/1-GFP. При этом Nt-4/1-GFP, который в отсутствие CPL3С-mRFP локализуется в цитоплазматических тельцах, в случае ко-экспрессии локализовался в цитоплазме диффузно. Таким образом, показано, что фрагмент белка Nb-CPL3 радикально меняет внутриклеточную локализацию белка Nt-4/1-GFP, что является указанием на взаимодействие CPL3 и Nt-4/1 in vivo. Исследовано функциональное взаимодействие белка Nt-4/1 и белка р25, супрессора сайленсинга, кодируемого Х-вирусом картофеля, который вызывает протеасомную деградацию белка AGO1. Поскольку AGO1 контролирует уровень мРНК белка AGO2, содержащей мишень miR403, которая функционирует в комплексе с AGO1, было оценено влияние Nt-4/1 на способность р25 воздействовать на уровень мРНК AGO2. В опытах по агроинфильтрации с помощью ПЦР в реальном времени обнаружено, что в отсутствие белка р25 Nt-4/1 не влияет на уровень мРНК AGO2. Статистически достоверно показано значительное снижение количества мРНК AGO2 в присутствии белков 25K и Nt-4/1 в сравнении с экспрессией одного белка 25K. Было обнаружено, что при этом уровень мРНК AGO1 в присутствии белков Nt-4/1 и р25 составлял 76% от уровня этой мРНК в присутствии только белка р25. Таким образом, причиной действия Nt-4/1 на уровень экспрессии AGO2 в присутствии р25 является не повышение уровня мРНК AGO1. Полученные данные указывают на то, что эффект Nt-4/1 реализуется на уровне белок-белковых взаимодействий, и что белок Nt-4/1 подавляет протеасомную деградацию белка AGO1, вызванную вирусным белком-супрессором сайленсинга р25. Проанализированы РНК-связывающие свойства белка NtPBL. Методом сдвига в агарозном геле показано, что NtPBL-С, который представляет собой С-концевую гидрофильную область белка NtPBL, связывает РНК GFP и вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК), демонстрируя более эффективное связывание РНК ВВКК с выраженной вторичной структурой. В экспериментах по связыванию NtPBL-С с другими РНК-субстратами со стабильной вторичной структурой показано, что NtPBL-C эффективно связывает тРНК и с еще большей аффинностью взаимодействует с предшественниками микро-РНК miR171 и miR390. Проведен мутагенез NtPBL-C и анализ РНК-связывающих свойств полученных мутантов. Обнаружено, что мутация, внесенная в С-концевой участок белка, полностью блокировала его способность связывать предшественник miR171, но не приводила к утрате способности образовать комплексы с ВВКК. Таким образом, показано, что C-концевая область белка NtPBL участвует в высокоспецифичном связывании предшественников микро-РНК. Исследовано влияние экспрессии гидрофильной области NtPBL (NtPBL-C) в растениях на фенотип вирусной инфекции. Показано, что экспрессия NtPBL-C в растениях N. benthamiana с помощью вектора на основе вируса погремковости табака (ВПТ) приводит к существенному изменению фенотипа виусной инфекции. В контрольных растениях, инокулированных ВПТ, на 15-й день после инфильтрации наблюдалась мягкая мозаика и умеренная задержка роста в сравнении с незараженными растениями. В случае растений, инфильтрированных ВПТ-NtPBL-C, наблюдалась сильная задержка роста (карликовость) и существенные нарушения нормальной морфологии верхних листьев растений. Эти фенотипические эффекты экспрессии NtPBL-C в контексте генома ВПТ сходны с аномалиями развития, наблюдаемыми при нарушении биогенеза и/или функций микро-РНК.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".